[发明专利]一种高效获得转基因萝卜的方法

说明书

本发明公开了一种高效获得转基因萝卜的方法。该方法包括以下步骤：(1)制备浸花材料；(2)构建并纯化pCAMBIA3301‑eGFP载体质粒；(3)农杆菌制备；(4)浸染；(5)收种。本发明使获得萝卜转基因植株的操作更加简便，不用再通过复杂且不稳定的萝卜再生体系，减少了花费在萝卜组织培养上的时间和金钱，降低了实验成本30％以上；同时，将萝卜遗传转化效率从传统方法的不足0.2％，增加到约1％，提高了近5倍。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种高效获得转基因萝卜的方法。

背景技术

萝卜(Raphanus sativus L.)是我国重要的十字花科蔬菜作物，年种植面积在120万公顷左右，位居全国第三，在蔬菜生产和供应上起到了重要作用。在基础研究方面，萝卜的科研工作进展却与其栽培生产地位及重要程度极度不符。尤其在分子生物学方面，虽然萝卜全基因组测序工作已于2014年由日本科学家完成，并在2015年(日本)、2016年(韩国)接连发表了两个更加完整的全基因组数据库，但由于萝卜遗传转化效率低，通过再生体系的操作复杂且不稳定，导致很多基因功能验证等实验，只能在同属十字花科的拟南芥上进行，验证结果无法真实反映萝卜本身的情况，而类似CRISPR基因编辑等前沿科学技术至今无法在萝卜上顺利进行。综上原因，萝卜基础研究整体水平一直处于中下水平，较高影响因子期刊(IF>5.0)上发表的论文寥寥无几。萝卜转化率低，获得转基因植株困难，已然成为严重滞后萝卜分子生物学方面研究进程的主要原因之一。

农杆菌介导的浸花遗传转化方法，是现有不依赖组织培养的植物遗传转化方法中较为简便的。利用浸花的方法进行转基因，其优点在于避免了组织培养和再生过程，直接得到转基因T₀代种子，且相对于其他无需组培的方法，其对仪器设备和技术操作的要求都比较低。因此，浸花法适用于组织培养和离体再生困难的植物。浸花法的研究历史悠久，最早于1987年在十字花科的拟南芥中已实验成功并进行了报道，同属十字花科的甘蓝型油菜中亦可进行浸花法遗传转化。但由于萝卜为典型的异花授粉植物，绝大多数材料自交不亲和性强，直接授粉无法自交结实或结实极少，因此农杆菌介导的浸花遗传转化方法在萝卜遗传转化研究中未见报道。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种高效获得转基因萝卜的方法，能获得稳定的萝卜再生体系。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种高效获得转基因萝卜的方法，包括以下步骤：

(1)制备浸花材料

将出芽5～6天后的萝卜培养40～50天后，拔出萝卜，去除其茎尖生长点以上的叶片，再于4～8℃中保存20～30天，筛选出未受病害的萝卜，栽种于3000～5000lx光照条件下，培育至抽薹开花，并去除已开花花朵后，备用；

(2)构建并纯化pCAMBIA3301-eGFP载体质粒；其中，该eGFP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(3)农杆菌制备

将纯化后的pCAMBIA3301-eGFP载体质粒转化至感受态细胞中，进行菌落鉴定后，于-80～-60℃保存；

(4)浸染

将步骤(1)保存的萝卜植株取出，待其上的花朵开花后，置于浸染液中浸染1～5min，并对花朵进行套袋，遮光培育5～7天后，再次对花朵浸染1～5min，重复3～5次；

(5)收种

在步骤(4)浸染结束30～40天后，待种子成熟后采收即可。

进一步地，步骤(1)中萝卜为具有自交结实能力的萝卜。

进一步地，该萝卜为紫花萝卜。