[发明专利]一种高效获得转基因萝卜的方法

权利要求书

1.一种高效获得转基因萝卜的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备浸花材料

将出芽5～6天后的萝卜培养40～50天后，拔出萝卜，去除其茎尖生长点以上的叶片，再于4～8℃中保存20～30天，筛选出未受病害的萝卜，栽种于3000～5000lx光照条件下，培育至抽薹开花，并去除已开花花朵后，备用；

(2)构建并纯化pCAMBIA3301-eGFP载体质粒；

(3)制备农杆菌

将纯化后的pCAMBIA3301-eGFP载体质粒转化至感受态细胞中，进行菌落鉴定后，于-80～-60℃保存；

(4)浸染

将步骤(1)保存的萝卜植株取出，待其上的花朵开花后，置于浸染液中浸染1～5min，并对花朵进行套袋，遮光培育5～7天后，再次对花朵浸染1～5min，重复3～5次；

(5)收种

在步骤(4)浸染结束30～40天后，待种子成熟后采收即可。

2.根据权利要求1所述的高效获得转基因萝卜的方法，其特征在于，步骤(1)中所述萝卜为具有自交结实能力的萝卜。

3.根据权利要求1所述的高效获得转基因萝卜的方法，其特征在于，步骤(2)中载体质粒的构建过程为：

(1)分别对质粒pCAMBIA3301和pUC57-eGFP进行提取纯化，然后再采用HindIII和Sac I分别对质粒pCAMBIA3301和pUC57-eGFP进行双酶切反应；

(2)于37℃，温浴12h后，分别电泳回收质粒pCAMBIA3301的大片段和质粒pUC57-eGFP的小片段；

(3)用T4连接酶连接步骤(2)回收得到的片段，并在16℃反应12h，得到pCAMBIA3301-eGFP载体质粒。

4.根据权利要求1所述的高效获得转基因萝卜的方法，其特征在于，步骤(3)中所述感受态细胞为农杆菌GV3101。

5.根据权利要求1所述的高效获得转基因萝卜的方法，其特征在于，步骤(4)中所述浸染液的制备方法为：

(1)将步骤(3)中冻存的农杆菌菌液取出，于抗性LB固体培养基平板上划线后，倒置于28℃培养箱中培养48小时，挑取单菌落，并加入抗性LB液体培养基中，于28℃、200r/min振荡培养12小时；

(2)培养结束后，转入至抗性LB液体培养中，于28℃、200r/min继续振荡培养12～16h，至菌液OD值为0.6～0.8时取出；

(3)然后于5000rpm离心10～15min，收集菌体，再用含有5％蔗糖、0.1％silwet的MS液体培养基对菌体进行重悬即可。

6.根据权利要求5所述的高效获得转基因萝卜的方法，其特征在于，所述抗性LB固体培养基包括50μg/mL的卡那霉素、50μg/mL的利福平以及50μg/mL的庆大霉素。

7.根据权利要求5所述的高效获得转基因萝卜的方法，其特征在于，步骤(1)中所述抗性LB液体培养基包括50μg/mL的卡那霉素、50μg/mL的利福平以及50μg/mL的庆大霉素。

8.根据权利要求5所述的高效获得转基因萝卜的方法，其特征在于，步骤(2)中所述抗性LB液体培养基包括50μg/mL的卡那霉素、25μg/mL的利福平以及50μg/mL的庆大霉素。