[发明专利]带有荧光标记的PD-L1膜表面表达细胞模型及其应用

说明书

带有荧光标记的PD‑L1膜表面表达细胞模型及其应用，细胞模型是可表达PD‑L1成熟蛋白全长序列的真核宿主细胞，所述真核宿主细胞由构建完成的真核荧光表达载体转染至293T细胞形成，所述真核荧光表达载体在293T细胞中瞬时表达PD‑L1蛋白，并将PD‑L1蛋白展示在293T细胞表面，细胞模型在筛选能与PD‑L1结合的多肽和抗体中的应用。本发明是将牛Fc γ受体信号肽序列代替原来PD‑L1基因上的信号肽，能将PD‑L1更高效的锚定在细胞膜上，以便将犬的PD‑L1成熟蛋白大量展示在真核细胞膜表面。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体属于带有荧光标记的PD-L1膜表面表达细胞模型及其应用。

背景技术

程序性死亡受体1（Programmed death 1，PD-L1，CD279）属于CD28家族成员，在B淋巴细胞、T淋巴细胞、NK细胞、树突状细胞和单核细胞均有表达，其配体PD-L1（Programmeddeath ligand 1，CD274）属于B7家族成员，作为PD-L1的主要配体，PD-L1主要表达于肿瘤细胞、淋巴细胞、上皮细胞中。癌症是致犬死亡的常见病之一，目前治疗犬癌症的方法有手术、化疗和放疗。除此之外，免疫治疗也备受关注，一些针对免疫检查点分子的药物的研制取得了成功。在许多临床试验中，抗PD-L1抗体显示出了良好的抗肿瘤活性，特别是针对黑色素瘤、非小细胞肺癌和其他癌症的临床治疗中显示了极其显著的疗效。同样在人体中，抗 PD-1 和抗 PD-L1 抗体已被用于晚期黑色素瘤的治疗，并且显示出良好的疗效果。目前日益增多的相关研究结果表明，犬类部分肿瘤的发生机制与人类有着很高的相似性，PD-1及PD-L1这一类免疫检查点分子阻断多肽和抗体在治疗犬类黑色素瘤、骨肉瘤、血管瘤等方面同样表现出了极大的应用潜力和价值。

在传统的阻断PD-1/PD-L1通路的多肽开发中多利用计算机辅助设计，通过大量计算得出理论上最佳的多肽序列，但在实际操作中却不尽如人意。在验证设计多肽与PD-1或PD-L1的结合能力时，多使用PBMC；原核或者真核表达的蛋白作为底物。PBMC细胞膜表面蛋白质分子复杂，即使有结合能力，也无法判断是否和PD-1或PD-L1蛋白结合。设计的药物最终还是要应用到动物体内，原核表达的蛋白没有天然的空间三维结构，真核表达的蛋白虽然有空间三位结构，但是真核细胞表达蛋白的成本高，表达量低。本发明制备了一种高表达PD-L1蛋白的细胞模型用于筛选能和PD-L1蛋白结合的多肽或者抗体。

发明内容

本发明的目的是提供带有荧光标记的PD-L1膜表面表达细胞模型及其应用，要解决现有技术中不能快速、高效的筛选与PD-L1蛋白结合多肽或抗体的技术问题。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

带有荧光标记的PD-L1膜表面表达细胞模型，其特征在于：所述细胞模型是可表达PD-L1成熟蛋白全长序列的真核宿主细胞，所述真核宿主细胞由构建完成的真核荧光表达载体转染至293T细胞形成，所述真核荧光表达载体在293T细胞中瞬时表达PD-L1蛋白，并将PD-L1蛋白展示在293T细胞表面。

进一步优选地，所述真核荧光表达载体为pECFP-Fc-PD-L1重组载体，先由添加Kozak序列和酶切位点的牛Fc γ受体信号肽序列，插入到真核表达载体pECFP-N1的多克隆位点中形成pECFP-Fc重组载体，之后构建T-PD-L1重组载体，将pECFP-Fc重组载体和T-PD-L1重组载体进行酶切酶连形成pECFP-Fc-PD-L1重组载体。

进一步地，所述PD-L1成熟蛋白全长序列位于牛Fc γ受体信号肽序列的下游，并与真核表达载体pECFP-N1中的EYFP蛋白融合表达。

进一步地，所述PD-L1成熟蛋白全长序列是犬PD-L1成熟蛋白全长序列，其DNA序列是如SEQ ID No:1所示序列。

此外，所述pECFP-Fc-PD-L1重组载体DNA完整序列是如SEQ ID No:2所示序列。