[发明专利]一种海洋发光细菌冻干保护剂及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种海洋发光细菌冻干保护剂及其制备方法和应用，属于微生物冻干保护剂范畴。该保护剂由以下配比的原料组成：8wt%~20wt%脱脂乳，4%~8%蔗糖，0.05%~1.5%壳聚糖，0.1%~2%谷氨酸钠，0.01%~1.0%四氢嘧啶，余量为蒸馏水。该保护剂经配液、灭菌和混合制备而成。使用该保护剂制得的海洋发光细菌冻干粉中，于2~8℃下保存18个月后，菌种恢复发光率及菌种发光性能均维持稳定，能极大提高海洋发光细菌菌种的保存效果和质量。

技术领域

本发明设计一种专门针对海洋发光细菌长期保存的冻干保护剂配方及其制备方法和应用，属于微生物冻干保护剂范畴。

背景技术

随着我国工农业的高速发展，各种生态环境污染问题严峻，对生态环境和人体健康带来很大威胁。目前，生物毒性检测实验主要有鱼类急、慢性、蚤类毒性、藻类毒性及微生物毒性实验（如发光细菌对污染物毒性的发光抑制）等。而基于发光细菌为指示物的生物毒性检测法已广泛应用于农药残留、重金属毒性与生物毒素等方面的检测。发光细菌在外界毒物干扰下发光生理过程会受到干扰，从而引起发光强度的变化，且发光值降低程度与外界毒性物质的在一定程度里面呈比例关系，从而通过发光亮度变化反应环境毒性强弱。发光细菌法因其检测速度快、简便、灵敏程可靠、成本低等特点而备受关注。

发光细菌用于环境毒性检测过程中，菌种是重要的影响因素。目前，市场上常用的发光细菌菌种包括两类海水细菌（明亮发光杆菌和费氏弧菌）和一类淡水细菌（青海弧菌）。其中以明亮发光杆菌在《水质急性毒性的测定发光细菌法》（GB/T15441-1995）中所使用；费氏弧菌在欧盟的标准中所使用。

目前，用于毒性检测的发光细菌较多为鲜活细菌，无法长期保存，而菌种制成冻干制品后可以长期保存，从而简化使用发光细菌法的前期工作。冻干制品直接由冰晶升华而制成，具有多孔结构，既能使细菌保持原有活性，又不会破环细胞的形态以及特性。冷冻干燥是将细菌悬浮液冷冻到冰点以下，从而转变为固体结晶态，然后在低温低压(真空)下使固体升华而脱水的干燥方法。干燥处理过程会破坏微生物的细胞膜，引起细胞的大量死亡，通过添加低温保护剂，能够使细菌悬浮，减少活菌在冻干过程中的死亡。因此，在冻干前加入的保护剂配方就成为了至关重要的决定性因素，它既会影响到储存期细胞的活性以及稳定性，也会影响到复水时细胞存活率。

因此，为提高冷冻干燥后菌种的存活率、恢复发光率以及长时间保存的稳定性，研制一种配方简单、安全性好、效果好的发光细菌冻干保护剂有积极的实用价值。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是一种海洋发光细菌冻干保护剂配方。同时，本发明还提供一种海洋发光细菌冻干保护剂的制备方法及应用。本发明令人惊奇地发现，使用本发明的冻干保护剂与菌种制成冻干制品后，显著提高冷冻干燥后菌种的存活率、恢复发光率以及长时间保存的稳定性。本发明基于上述发现而得以完成。

为了实现以上目的，本发明采用的技术方案是：

本发明的一种冻干保护剂是由以下配比的原料组成：脱脂乳的含量为8wt%~20wt%，蔗糖的含量为4wt%~8wt%，壳聚糖的含量为0.05 wt%~1.5wt%，谷氨酸钠的含量为0.1wt%~2wt%，四氢嘧啶的含量为0.01wt%~1.0wt%，余量为蒸馏水。

优选的，本发明的一种冻干保护剂是由以下配比的原料组成：脱脂乳的含量为10wt%~18wt%，蔗糖的含量为5wt%~7wt%，壳聚糖的含量为0.15 wt%~1.25wt%，谷氨酸钠的含量为0.12wt%~1.8wt%，四氢嘧啶的含量为0.02wt%~0.8wt%，余量为蒸馏水。

所述的脱脂乳的脂肪含量≤ 2.0%，且蛋白质含量≥30%。

所述的壳聚糖分子量为100KDa，脱乙酰度为80%。

所述的一种海洋发光细菌冻干保护剂的制备方法，包括以下步骤：