[发明专利]枯草芽孢杆菌的发酵方法及其菌剂的制备方法

说明书

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌的发酵方法及其菌剂的制备方法，枯草芽孢杆菌的发酵方法的步骤中包含：将枯草芽孢杆菌菌株接种到PDA培养基上活化培养；将PDA培养基上的枯草芽孢杆菌菌株移至种子液培养基振荡培养；调整种子液培养基中的菌液浓度至10⁹个细胞/mL，作发酵用一级种子液；将一级种子液接种于发酵培养基发酵培养，得二级种子液；将二级种子液接种于产芽孢发酵培养基发酵培养，并在培养过程中通入空气，得到发酵液。本发明的枯草芽孢杆菌的发酵方法可以通过二级种子液直接进入大生产阶段，发酵密度高，生产效率高。

技术领域

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌的发酵方法及其菌剂的制备方法。

背景技术

芽孢杆菌(Bacillus spp.)是内生芽孢的革兰氏阳性细菌，是目前生防细菌中研究较多的一类，因其能够产生耐热、耐旱、抗紫外线和有机溶剂的内生孢子，是理想的生防菌筛选对象。研究表明，目前应用于防治植物病害的芽孢杆菌属细菌有枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)等。植物根际土壤作为受植物活根影响的土壤微区，含有大量的微生物，包括真菌、细菌、放线菌、藻类、原生动物等。在植物根际微生物中，细菌生长快，也最常见，并且种类繁多，在土壤营养元素循环、有机物质的形成和分解、肥力的保持和提高、生态环境的改善、植物的生长发育等方面均起着极其重要的作用，被认为是良好的有益微生物资源库。近些年来，利用土壤中的有益细菌及其代谢产物防治植物病害更是成为国内外研究的热点。

枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种,广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖而得名。该菌单个细胞为(0.7-0.8)μm×(2-3)μm，着色均匀。无荚膜，有鞭毛，能活动，革兰氏染色为阳性，芽孢(0.6-0.9)μm×(1.0-1.5)μm，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时常形成皱壁，为需氧型细菌。可以利用蛋白质、多种糖，分解色氨酸。其中枯草芽孢杆菌在生物防治上很具有潜力，在温度和通气等适宜条件下，幼龄细胞中大量形成芽孢。另外，枯草杆菌生长速度快，对营养要求比较低，能高效分泌许多蛋白及代谢产物，且其不会产生毒素，是一种无致病性的安全微生物。在医药卫生食品等方面用途很广。

就目前枯草芽孢杆菌的液体发酵技术而言，通常需要经过三级种子扩大培养后才能进入大生产阶段，发酵密度低，生产效率低，且保存时间短。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种枯草芽孢杆菌的发酵方法，它可以通过二级种子液直接进入大生产阶段，发酵密度高，生产效率高。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是：一种枯草芽孢杆菌的发酵方法，方法步骤中包含：

将枯草芽孢杆菌菌株接种到PDA培养基上活化培养；

将PDA培养基上的枯草芽孢杆菌菌株移至种子液培养基振荡培养；

调整种子液培养基中的菌液浓度至10⁹个细胞/mL，作发酵用一级种子液；

将一级种子液接种于发酵培养基发酵培养，得二级种子液；

将二级种子液接种于产芽孢发酵培养基发酵培养，并在培养过程中通入空气，得到发酵液。

进一步，在无菌条件下用接种环挑取PDA培养基上的枯草芽孢杆菌菌株至种子液培养基进行振荡培养。

进一步，振荡培养的条件为，28℃下以180r/min振荡培养；

和/或一级种子液接种于发酵培养基发酵培养的培养条件为，发酵12～18h，并在发酵培养过程中以140～180r/min的搅拌速度搅拌；