[发明专利]组合利用琼胶酶制备新琼二糖的方法、重组宿主细胞及重组宿主细胞与表达载体的应用

说明书

本发明公开了一种组合利用内切型和外切型琼胶酶降解琼脂或或粗琼胶(红藻多糖提取物)获得高纯度新琼二糖的方法。本发明涉及一种琼胶酶AgaA和一种双功能酶AgaB，其中AgaA为内切型琼胶酶，能够迅速降解琼脂或琼脂糖产生新琼二糖、四糖和六糖，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；AgaB为双功能外切型琼胶酶，同时具有降解琼脂糖和紫菜多糖(即硫酸酯化的琼脂糖)的活性，能够降解琼脂或粗琼胶(红藻多糖提取物)或其寡糖产生单一产物新琼二糖，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。同时本发明还公开了利用基因工程技术重组表达和制备琼胶酶的方法。本发明所涉及的制备高纯度新琼二糖的方法及特异性琼胶酶(或紫菜多糖酶)，在制备琼胶寡糖领域有着广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于酶工程和基因工程技术领域，具体涉及利用特异性琼胶酶制备新琼寡糖的方法，特别是组合使用内切型琼胶酶和外切型双功能琼胶酶制备高纯度新琼二糖的方法。

背景技术

琼胶又叫琼脂、洋菜、冻粉、寒天、燕菜等，因其独特的天然性质和丰富的营养价值被广泛应用在各大工业领域。琼胶是从石花菜科和龙须菜科红藻类细胞壁中提取的水溶性多糖物质，由琼脂糖和琼脂胶两部分组成，其中琼脂糖是由(1-3)-O-β-D-半乳糖和(1-4)-O-3,6-内醚-α-L-半乳糖交替组成的线形链状分子，琼脂胶成分较复杂主要由长短不一的半乳糖残基的多糖链组成。琼胶具有良好的稳定性及凝胶性，常被用作微生物培养基、琼脂糖凝胶电泳、和色谱支持材料，也被认为是一种安全的食品添加剂，用于糖衣、釉料、加工奶酪、果冻糖等。但近年来随着琼胶自身应用的局限性，琼胶寡糖逐渐成为研究热点。目前降解琼胶的方法主要有化学法和酶促降解法，尽管化学法成本较低，但存在操作条件难控制、产物不均一、产物分析和回收难等问题，而利用酶解法制备琼胶寡糖,不仅反应条件温和，能耗低，而且酶催化具有高效性和专一性，能选择性地切断糖苷键，可克服化学降解法存在的问题，能实现更高效的寡糖生产。

琼胶酶是一类能够催化琼胶降解为琼胶寡糖的酶，根据其裂解琼胶的模式不同可将琼胶酶分为两类即α-琼胶酶和β-琼胶酶，其中α-琼胶酶切割琼脂糖的α-1,3键以产生琼脂寡糖，β-琼胶酶切割成β-1,4键以产生新琼寡糖。目前已经报道的文献中大多都是β-琼胶酶，且属于糖苷水解酶家族GH16、GH50、GH86 和GH118家族，其中GH16家族最为丰富，家族中已经超过了3000个功能异质的成员，但关于α-琼胶酶鲜有报道，只有在以下四种海洋细菌中鉴定出α-琼胶酶，Thalassomonas sp.LD5、Thalassomonas sp JAMB-A33和Alteromonassp.SH-1 及Alteromonas agalyticus GJ1B。琼胶酶主要来源于微生物和动物，在浩瀚的海洋生态系统中，丰富的海洋植物、动物、海水及海洋沉积物中都存在有产琼胶酶的细菌。

相对于琼脂应用的局限性，琼胶寡糖更具有多样的生物活性及巨大的应用价值，在医药方面，天然多糖因其粘度高、溶解性低，影响了其在医药、动物保健、食品等领域的应用，而不同聚合度的琼胶寡糖，被证明具有良好的抗肿瘤、抗病毒、增强免疫等药理作用和生物活性。同样在食品生产、化工等方面也有广阔的应用前景。目前运用生物酶法制备琼胶寡糖的工艺并不完善，大部分挖掘到的琼胶酶对琼脂糖降解效率较高，但对琼脂或者粗琼胶的降解效率较低。就产物而言，获得的寡糖产物聚合度也不均一，多以新琼四糖，六糖，八糖等混合物为主要产物。而不同聚合度的寡糖其生物活性和应用价值也存在很大差异，若不能得到聚合度单一的寡糖对其后续的应用会产生很大的影响。