[发明专利]一种供临床使用的脱细胞角膜基质的制备方法

说明书

本发明公开了一种供临床使用的脱细胞角膜基质的制备方法，该方法包括去除角膜上皮层之后削切得到预定厚度的板层角膜，还包括将削切后的板层角膜密封后置于液氮中冷冻、将冷冻后的板层角膜置于水浴中解冻、将解冻后的板层角膜放入脱细胞试剂中进行振荡处理、将振荡处理后的板层角膜置于等渗液中进行超声处理、将脱细胞后的板层角膜放入软化液中静置，冷冻、解冻以及在脱细胞试剂中振荡处理有利于脱除细胞，在软化液中静置有利于角膜胶原微观结构的恢复，再放入水中振荡处理，得到透明性好,微观胶原结构接近于人体角膜并且不需经过其他处理而直接能供临床使用的脱细胞角膜基质。

技术领域

本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种供人类临床使用的脱细胞角膜基质的制备方法。

背景技术

引起角膜盲的第二大原因是角膜病，角膜病中80％的患者可通过角膜移植来避免致盲。但是受我国角膜捐献较少，导致同种异体角膜供体匮乏，人工角膜的出现给角膜病患者带来了希望。随着组织工程学的兴起，人们将焦点集中在天然的动物角膜材料。利用脱细胞的方法去除异种角膜的外源细胞及抗原物质，从而获得异种无细胞的角膜细胞外基质材料。组织工程角膜材料在临床应用须要满足三个最基本的要求，一是异种角膜细胞被脱除的彻底性，二是角膜的透明度，三是角膜的生理弧度。组织工程角膜材料移植到患者身上时，如果异种细胞脱除不彻底，将产生免疫排斥反应，导致移植效果不佳；如果脱细胞过程中对角膜微观结构破坏较大，移植后透明度恢复不好，依然影响患者视力，患者的生活并未得到改善；因此，影响角膜术后透明度的主要因素有：异种细胞脱除是否彻底，角膜是否具有其原有的胶原微观结构，以及角膜是否具有其原有的生理弧度，这些因素将决定角膜材料能否在临床上成功应用。

目前常用的脱细胞方法包括化学法、物理法和生物酶法。常规单一的化学法或者物理法脱细胞需要长时间的作用才能达到脱细胞效果，且长时间的作用又会造成角膜胶原蛋白的微观结构破坏。专利文献201510074946.7(专利名称：一种人工角膜的制备方法)利用板层刀制备板层角膜，钻取指定大小的角膜片，通过冻融、超声联合核酸内切酶降解法进行脱细胞。该方法中利用板层刀获取板层角膜，无法保证切面的平整性，从而影响移植后与植床的贴合性，导致术后透明度的恢复。专利文献201410230365.3(专利名称：一种板层角膜基质支架及其制备方法)将动物角膜依次进行低渗溶胀、反复冻融、利用DNA酶和RNA酶的缓冲体系进行酶消化处理。专利文献201610080864.8(专利名称：利用新鲜牛角膜以制备牛角膜基质的方法及应用方法)将牛角膜浸泡在低渗溶液中，取出角膜上皮细胞得到包含前弹力层和比分基质层的牛角膜基质，反复冻融后再用缓冲液漂洗，放入脱细胞试剂中浸泡脱细胞，再用超纯水对牛角膜基质进行冲洗，最后放入脱水剂中浸泡、灭菌，制得牛角膜基质。以上两件专利技术均使用了低渗溶液，这种溶液致使角膜易溶胀，对角膜基质结构破坏性较大，且未对脱细胞后的角膜进行孵育软化。

发明内容

针对现有技术的缺点和局限，本发明提供一种采用物理方法和低毒性试剂，制备得到透明性好,微观胶原结构接近于人体角膜并且能供临床使用的脱细胞角膜基质的方法。该方法包括：去除角膜上皮层之后削切得到预定厚度的板层角膜，还包括：

a)将削切后的角膜密封后置于液氮中冷冻；

b)将冷冻后的角膜置于水浴中解冻；

c)将解冻后的角膜放入脱细胞试剂中进行振荡处理；

d)将振荡处理后的角膜置于等渗液中进行超声处理，以脱除细胞；

e)将脱细胞后的角膜放入软化液中静置，再放入水中振荡处理；所述软化液具有促进角膜胶原微观结构恢复的作用。

在本发明非限制性的实施方式中，所述预定厚度为200-500μm，本领域技术人员也可根据后续处理要求及临床使用需求确定板层角膜的厚度。申请人经过大量试验总结认为，当厚度为200-500μm时，既便于后续处理，又使制成的角膜能够满足临床使用需求。