[发明专利]一种人呼吸道合胞病毒粘膜疫苗及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种人呼吸道合胞病毒粘膜疫苗及其制备方法和应用。本发明应用大肠杆菌BL21表达纯化了由粘膜佐剂CTA1‑DD和融合前构象的F蛋白构成的融合蛋白CTA1‑DD‑F，滴鼻免疫小鼠发现，该融合蛋白可刺激特异性体液免疫应答(IgG1、IgG2a、IgA及中和抗体)和细胞免疫应答，与FI‑RSV相比，滴鼻免疫引起Th1类的免疫应答并且引起很小的肺脏病理损伤。此外，与添加CpG佐剂的F蛋白免疫组相比，CTA1‑DD‑F鼻内免疫诱导的血清中和抗体滴度更高，能够有效清除小鼠肺部的病毒。因此，CTA1‑DD粘膜佐剂适用于RSV粘膜疫苗，CTA1‑DD‑F是预防hRSV的潜在候选疫苗。

技术领域

本发明涉及一种由粘膜佐剂CTA1-DD和融合前构象的F蛋白构成的融合蛋白及其制备方法，还涉及由该融合蛋白制备而成的人呼吸道合胞病毒粘膜疫苗和应用。本发明属于医药技术领域。

背景技术

人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,hRSV)是1957年美国科学家从患有肺炎的儿童体内分离，2017年国际病毒分类委员会将RSV划分到肺病毒科(Pneumoviridae)正肺病毒属(Orthopneumovirus)，包含AB两种血清亚型。

RSV可以通过飞沫吸附于呼吸道粘膜，引起肺炎和支气管炎，主要感染婴幼儿和老年人，感染婴幼儿较重，常常发生下呼吸道感染，严重导致死亡。儿童及成年人上呼吸道较轻。2005年全球大约有66000～199000个小于5岁的儿童死于RSV感染引起的急性下呼吸道感染，其中99％发生在发展中国家。2015年320万名患者因感染RSV住院，导致59600小于5岁的儿童死亡，其中包括27300名小于6个月的婴儿。在许多发达国家RSV的防控很全面，但是在一些中等收入的国家RSV防控比较落后，部分儿童感染RSV后未送进医院并导致死亡，这些病例在统计中往往被忽略。早产儿、支气管和肺发育异常以及先天性心脏病的孩子最容易感染RSV。

hRSV是一种单股负链RNA病毒，含有10个基因，能够编码形成11种蛋白质，其中F蛋白和G蛋白是主要的保护性抗原，G蛋白在结构蛋白中变异最显著，参与病毒的吸附过程。F蛋白相对保守，产生的抗体中和活性高，且能对AB两个亚型产生中和作用，因此RSV疫苗的绝大多数研究都是针对F蛋白的。F蛋白属于I型跨膜糖蛋白，全长574个氨基酸，在109和137位点有弗林蛋白酶切割位点，将F蛋白切割成F2、P27和F1三个片段，切割后F1和F2由两条二硫键连接形成异二聚体，然后三个异二聚体形成三聚体。这种三聚体包含两种构象(pre-F和post-F)，pre-F是一种亚稳定结构，可以向稳定的post-F转变(5)，人体血清中具有强中和活性的抗体大部分由pre-F产生(Ngwuta JO,Chen M,Modjarrad K,Joyce MG,KanekiyoM,Kumar A,Yassine HM,Moin SM,Killikelly AM,Chuang G-Y,Druz A,Georgiev IS,Rundlet EJ,Sastry M,Stewart-Jones GBE,Yang Y,Zhang B,Nason MC,Capella C,Peeples ME,Ledgerwood JE,McLellan JS,Kwong PD,Graham BS.2015.Prefusion F–specific antibodies determine the magnitude of RSV neutralizing activity inhuman sera.Science Translational Medicine 7:309ra162-309ra162.)，因为pre-F具有一个特有的构象表位针对该表位的单克隆抗体有5C4、AM22和D25等，其中D25单抗(MEDI8897)作为治疗性药物已经进入临床试验，5C4是厦门大学夏宁邵团队研制的鼠源抗体。抗原位点II存在于pre-F和post-F中，针对该表位的单克隆抗体有Palivizumab，Motavizumab，其中Palivizumab是一种人源化的小鼠单克隆抗体，也是唯一被批准使用的治疗性单抗。