[发明专利]基于重组中华乌塘鳢卵黄蛋白原在水体雌激素污染检测方法及应用

权利要求书

1.中华乌塘鳢卵黄蛋白原的水体雌激素污染的检测方法，其特征在于所述卵黄蛋白原为重组中华乌塘鳢卵黄蛋白原或中华乌塘鳢血液、肝脏提取获得的卵黄蛋白原，检测方法包括以下步骤：

（1）应用基因工程原理克隆中华乌塘鳢卵黄蛋白原全长基因，选择其中一段819bp核苷酸序列进行克隆和原核表达，819bp核苷酸序列如SEQ NO 3所示，经纯化和浓缩获得融合蛋白；

（2）制备中华乌塘鳢卵黄蛋白原多克隆抗体，包括以下步骤：

1）制备完全和不完全福氏佐剂，重组卵黄蛋白原溶液用PBS稀释至卵黄蛋白原浓度为0.1mg/mL，加入等体积完全福氏佐剂，用1mL注射器充分乳化，制成完全福氏佐剂；抗原溶液等体积与不完全福氏佐剂充分乳化后制成不完全福氏佐剂，采用皮下多点注射的方式进行注射；

2）注射佐剂前，先用卡介苗刺激BalB/C小鼠的腘窝和足掌，激活小鼠免疫功能，一周后开始免疫完全福氏佐剂；

3）第一次采用重组中华乌塘鳢卵黄蛋白原融合蛋白完全福氏佐剂免疫BalB/C小鼠；间隔10天后采用不完全福氏佐剂免疫小鼠，共免疫4次；

4）最后一次免疫7天后尾部取血ELISA检测抗体效价，符合要求后部分小鼠眼眶取全血，静止4小时后离心获得抗血清，即小鼠抗中华乌塘鳢卵黄蛋白原多克隆抗体；

（3）检测鉴定中华乌塘鳢卵黄蛋白原多克隆抗体，检测鉴定包括斑点杂交、ELISA方法检测抗体效价和DOT-blotting方法鉴定多克隆抗体；

（4）多克隆抗体在卵黄蛋白原测定实验中的应用。

2.根据权利要求1所述的中华乌塘鳢卵黄蛋白原的水体雌激素污染的检测方法，其特征在于，在步骤（3）中所述ELISA方法检测抗体效价步骤包括：

1）向酶标板凹孔中加入100 μL 卵黄蛋白原纯化蛋白标准品，在4℃条件下孵育16 h；

2）倒掉酶标板凹孔中的残余液体，晾干后每孔加入300 μL PBST-20，放置于摇床上振摇5 min，每次静置5 min后倒去溶液，晾干，重复进行3次；

3）向酶标板凹孔中加入250 μL 5 %脱脂牛奶，用封口膜密封酶标板，置于全温振荡培养箱中，在500 rpm条件下震荡温育1.5 h；

4）倒掉酶标板凹孔中的残余液体，每孔加入300 μL PBST-20，放置于摇床上振摇5min，每次静置5 min后倒去溶液，晾干，重复进行3次；

5）向酶标板凹孔中加入100 μL鼠抗卵黄蛋白原多克隆抗体，用封口膜密封酶标板，置于全温振荡培养箱中，在500 rpm条件下震荡温育1.5 h；

6）倒掉酶标板凹孔中的残余液体，每孔加入300 μL PBST-20，放置于摇床上振摇5min，每次静置5 min后倒去溶液，晾干，重复进行3次；

7）向酶标板凹孔中加入100 μL按1︰2000比例稀释的羊抗鼠IgG-HRP，用封口膜密封酶标板，置于全温振荡培养箱中，在500 rpm条件下震荡温育1.5 h；

8）倒掉酶标板凹孔中的残余液体，每孔加入300 μL PBST-20，放置于摇床上振摇5min，每次静置5 min后倒去溶液，晾干，重复进行3次；

9）将酶标板移入光线较弱的条件下，每孔中加入显色液100 μL，以封口膜密封酶标板，而后将酶标板以铝箔层层包裹，置于全温振荡培养箱中在温37℃、500 rpm条件下震荡温育45 min，取出后向孔内加入50 μL 0.5M硫酸，使反应停止；将板置于酶标仪下，于波长450nm处读取数据，计算卵黄蛋白原含量，获得小鼠抗卵黄蛋白原抗体与抗体稀释度的量效关系。