[发明专利]一种吡咯伯克霍尔德氏菌形成生物膜的方法

说明书

本发明公开了一种吡咯伯克霍尔德氏菌形成生物膜的方法，包括以下步骤：1)采用LB固体平板活化吡咯伯克霍尔德氏菌JK‑SH007菌种，获得单菌落，挑取单菌落进入LB液体培养基，180r/min，28℃纯培养24h，获得菌悬液；2)配制供试培养基TMG，在TSB培养基中加入1％v/v甘油和25mM MgSO₄，pH 5‑7；3)将菌悬液1％v/v接种至TMG液体培养基，180r/min，28℃纯培养24h取出后静置4‑6天，形成生物膜。本发明配制了一种可诱导JK‑SH007形成生物膜的培养基TMG，JK‑SH007经过该培养基培养后，可形成肉眼可见的生物膜，使得其在营养匮乏的环境下更好的存活。

技术领域

本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及一种吡咯伯克霍尔德氏菌形成生物膜的方法。

背景技术

吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)JK-SH007是杨树的一株高效革兰氏阴性生防菌，隶属于洋葱伯克霍尔德氏菌群(Burkholderia cepacia complex，Bcc)基因型IX。通过采用BCESM和cblA毒力基因的特异性PCR，洋葱(Allium cepa)、烟草(Nicotiana sp.)及苜蓿(Medicago sp.)模型等Bcc常用安全性检测技术对其毒性进行了初步检测，表明Burkholderia pyrrocinia JK-SH007是一株有潜力的安全生防菌株，前期的研究结果表明该菌对杨树溃疡病的三种病原菌：拟茎点霉(Phomopsis macrospora)、金黄克囊孢(Cytospora chrysosperm)、七叶树壳梭孢(Fusicoccum aesculi)具有强拮抗作用，也可以通过分泌一些生长激素如IAA，嗜铁素以及解磷等来促进植物生长(Ren et al.，2010；任嘉红等，2010；Yang et al.，2017)，所以，B.pyrrocinia JK-SH007被认为是一株有巨大潜力能应对杨树溃疡病的生防菌株。然而，在实际生产中，由于环境的复杂性和JK-SH007本身的生活史是浮游菌状态，它的生防效果将随时间增长显著大量的减少。

细菌生物膜(Bacterial biofilm，BF)是一个有组织且具有明显三维结构生命群体。细菌在该状态下的抗逆性远比浮游状态下的抗逆性强，且具有感知周围环境变化及快速摄取营养物质等优点，在自然界里寄主植物和细菌互作定殖过程中，细菌可以在其表面形成生物膜，这些生物膜被描述为微菌落、聚集体、细胞簇等，生物膜对有益生防菌在植物周围环境进行定殖具有明显的促进作用。

关于B.pyrrocinia JK-SH007形成生物膜形成的研究，有学者猜测B.pyrrociniaJK-SH007在自然条件下生长，控制生物膜形成的基因表达量遭到了抑制。目前，近几年关于B.pyrrocinia JK-SH007形成生物膜形成的研究较少。其中产生物膜难，培养基组成较复杂，耗时较长，很难同时保证JK-SH007有强大生命力和形成生物膜，若能解决该问题，这将为JK-SH007作为生防菌剂商业化进一步提供理论技术指导。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种吡咯伯克霍尔德氏菌形成生物膜的方法，培养基配制成分简单，形成生物膜容易，耗时较短，同时具有强大的生命力，抗逆性强，有助于提高生防效果。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种吡咯伯克霍尔德氏菌形成生物膜的方法，包括以下步骤：

1)采用LB固体平板活化吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007菌种，获得单菌落，挑取单菌落进入LB液体培养基，180r/min，28℃纯培养24h，获得菌悬液；

2)配制供试培养基TMG，在TSB培养基中加入1％v/v甘油和25mM MgSO₄，pH 5-7；

3)将菌悬液1％v/v接种至TMG液体培养基，180r/min，28℃纯培养24h取出后静置4-6天，形成生物膜。