[发明专利]杂交瘤细胞株105D11、抗体及其应用

说明书

本发明公开了一种杂交瘤细胞株105D11、其产生的抗人CD47单克隆抗体，本发明以具有生物活性的CD47重组蛋白为抗原，通过杂交瘤技术筛选制备得到能阻断CD47‑SIRPα相互作用的高亲和力抗人CD47特异性单克隆抗体，同时在体外实验中证明可以促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞并且不会引起红细胞凝集，因此该抗体在肿瘤免疫治疗中具有潜在的价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种杂交瘤细胞株105D11、其产生的能特异性且高亲和力结合人CD47的单克隆抗体，其制备方法及其可变区序列，以及其制药应用。

背景技术

正常情况下，免疫系统可以识别并清除肿瘤微环境中的肿瘤细胞，但为了生存和生长，肿瘤细胞能够采用不同策略，使人体的免疫系统受到抑制，不能正常的杀伤肿瘤细胞，从而在抗肿瘤免疫应答的各阶段得以幸存。肿瘤-免疫循环分为以下七个环节：1、肿瘤抗原释放；2、肿瘤抗原呈递；3、启动和激活效应性T细胞；4、T细胞向肿瘤组织迁移；5、肿瘤组织T细胞浸润；6、T细胞识别肿瘤细胞；7、清除肿瘤细胞。这些环节任何地方出现异常均可以导致抗肿瘤-免疫循环失效，出现免疫逃逸。不同肿瘤可以通过不同环节的异常抑制免疫系统对肿瘤细胞的有效识别和杀伤从而产生免疫耐受，甚至促进肿瘤的发生、发展。肿瘤免疫治疗就是通过重新启动并维持肿瘤-免疫循环，恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制与清除肿瘤的一种治疗方法。包括单克隆抗体类免疫检查点抑制剂、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞治疗和小分子抑制剂等。近几年，肿瘤免疫治疗的好消息不断，目前已在多种肿瘤如黑色素瘤，非小细胞肺癌、肾癌和前列腺癌等实体瘤的治疗中展示出了强大的抗肿瘤活性，多个肿瘤免疫治疗药物已经获得美国FDA批准临床应用。肿瘤免疫治疗由于其卓越的疗效和创新性，在2013年被《科学》杂志评为年度最重要的科学突破。

近年来，在免疫检查点抑制剂中最有名的便属PD1-PDL1抗体药等。肿瘤细胞通过上调表面PDL1蛋白表达从而逃离免疫监控，PD1-PDL1属于后天免疫中免疫检查点通路，近年来发现了先天免疫中的免疫检查点通路CD47-SIRPα在肿瘤免疫逃逸中发挥着至关重要作用。

CD47也被称为整合素相关蛋白(integrin associated protein，IAP)，其广泛的表达于许多正常与肿瘤细胞表面，可与信号调节蛋白α(Signal regulatory proteinα,SIRPα)、血小板反应蛋白(thrombospondin-1,TSP1)以及整合素(integrins)相互作用，介导细胞凋亡、增殖、免疫等一系列反应。CD47为5次跨膜蛋白，分子量在50kDa左右，属于免疫球蛋白超家族，胞外N端为IgV结构域。CD47在19世纪80年代首次被确认为人类卵巢癌的肿瘤抗原，继而CD47被发现在多种人类肿瘤类型中表达，包括急性骨髓白血病(AML)、慢性骨髓白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍金性淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)、膀胱癌和其他实体瘤。CD47是“自我”信号，代表“别吃我”，是调节巨噬细胞吞噬作用的一个重要信号。CD47可以与巨噬细胞表面SIRPα结合，磷酸化其ITIM，随后招募SHP-1蛋白，产生一系列的级联反应抑制巨噬细胞的吞噬作用。针对CD47-SIRPα信号通路，可以设计CD47抗体来阻断该通路，从而阻止肿瘤细胞免疫逃逸从而起到抗肿瘤作用。虽然国内外开发CD47抗体药的单位数量在逐渐增加，但截至目前尚未有产品上市，走在最前面的要数FORTY SEVEN公司的Hu5F9-G4处于临床二期。

发明内容

发明目的：针对上述现有技术，本发明提供了一种杂交瘤细胞株105D11、其产生的抗人CD47单克隆抗体，所述抗人CD47单克隆抗体的制备方法，所述抗人CD47单克隆抗体的可变区氨基酸序列及核酸序列，以及抗人CD47单克隆抗体的制药应用。

技术方案：本发明所述的杂交瘤细胞株105D11，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:C2019260，地址：武汉市武汉大学，保藏时间：2019年10月29日。