[发明专利]用于肿瘤浸润性淋巴细胞快速培养的饲养细胞的制备方法

说明书

本发明公开了一种用于肿瘤浸润性淋巴细胞快速培养的饲养细胞的制备方法，本发明所用技术为利用丝裂霉素C来处理外周血淋巴细胞得到饲养细胞，然后用饲养细胞与预培养的肿瘤浸润性淋巴细胞进行共培养。采用本发明的方法制作的饲养细胞扩增肿瘤浸润性淋巴细胞的效率与利用γ射线照射制作的饲养细胞扩增肿瘤浸润性淋巴细胞的效率相比效果更好，同时利用此法的成本显著降低。本发明方法制备方法简单易行，可以广泛推广应用。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，尤其涉及一种用于肿瘤浸润性淋巴细胞快速培养的饲养细胞的制备方法。

背景技术

肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor infiltrated lymphocytes,TIL)是离开血液循环，迁移到肿瘤附近的淋巴细胞，它们包括T细胞，B细胞，NK细胞等。它们可以起到杀伤癌细胞的作用。肿瘤中TIL的多少是预测癌症患者预后和对免疫疗法反应的重要指标。TIL疗法主要是将从患者新鲜肿瘤组织中分离的TIL在体外细胞的培养环境下进行快速扩增，将TIL的数目扩增到可以给患者进行回输的数量后再回输到病人体内。

目前已知的TIL体外扩增的技术用的是将分离的TIL体外进行预培养1-2周以后按照一定比例(通常为1:200)与经30-50Gyγ射线照射过的外周血淋巴细胞(PeripheralBlood Mononuclear Cells,PBMC)进行共培养，主要原理是利用γ射线照射PBMC，使其生长抑制后成为饲养细胞，在与TIL共培养的过程中，饲养细胞分泌的生长因子将促进TIL的快速增殖以达到治疗所用的细胞数量。但是这种方法需要专门的照射设备，并且照射成本比较高，而一般的研究机构并不具备此种设备，所以利用此方法进行大量体外扩增TIL对于一般研究机构来说不经济实惠。

发明内容

本发明的目的在于：针对现有技术中利用γ射线照射PBMC制备饲养细胞，照射成本高，不利于广泛使用的问题，提供一种用于肿瘤浸润性淋巴细胞快速培养的饲养细胞的低成本制备方法。

本发明采用的技术方案如下：

一种用于肿瘤浸润性淋巴细胞快速培养的饲养细胞的制备方法，包括以下步骤：

S1.饲养细胞的制备

1)外周血淋巴细胞的分离与培养：抽取非小细胞肺癌病人自体外周血，用磷酸盐缓冲液稀释后加入淋巴细胞分离液进行淋巴细胞的分离，然后用无血清的X-VIVO培养基在5％CO₂、37℃培养箱进行培养；

2)饲养细胞制备：过夜培养后将上述分离后的淋巴细胞进行细胞计数，调整细胞密度为1.5×10⁶cells/mL,加入丝裂霉素C处理1.5-2小时，离心，弃上清液，然后用X-VIVO培养基重悬浮和洗涤细胞，再离心，弃上清液，加入培养基重悬浮细胞，得到饲养细胞；

S2.肿瘤浸润性淋巴细胞的分离与预培养

将临床收集的非小细胞肺癌组织用无菌磷酸盐缓冲液冲洗后切成1-2mm³的组织块，然后加入肿瘤浸润性淋巴细胞培养基,放入5％CO₂、37℃培养箱培养2-3天后弃组织块，肿瘤浸润性淋巴细胞继续培养，每隔2-3天添加新鲜培养基，培养10-14天后，收集细胞，离心后，弃上清液，然后用培养基重悬浮和洗涤细胞，得到预培养的肿瘤浸润性淋巴细胞；

S3.饲养细胞与肿瘤浸润性淋巴细胞的共培养

将S1制得的饲养细胞与S2制得的预培养的肿瘤浸润性淋巴细胞分别离心后，用培养基重悬浮及洗涤两次，然后加入AIM-V/TIL培养基中，同时添加IL-2及CD3/CD28抗体，放入5％CO₂、37℃培养箱进行培养，每隔2-3天添加新鲜培养基。