[发明专利]用于肿瘤浸润性淋巴细胞快速培养的饲养细胞的制备方法

权利要求书

1.一种用于肿瘤浸润性淋巴细胞快速培养的饲养细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.饲养细胞的制备

1)外周血淋巴细胞的分离与培养：抽取非小细胞肺癌病人自体外周血，用磷酸盐缓冲液稀释后加入淋巴细胞分离液进行淋巴细胞的分离，然后用无血清的X-VIVO培养基在5％CO₂、37℃培养箱进行培养；

2)饲养细胞制备：过夜培养后将上述分离后的淋巴细胞进行细胞计数，调整细胞密度为1.5×10⁶cells/mL,加入丝裂霉素C处理1.5-2小时，离心，弃上清液，然后用X-VIVO培养基重悬浮和洗涤细胞，再离心，弃上清液，加入培养基重悬浮细胞，得到饲养细胞；

S2.肿瘤浸润性淋巴细胞的分离与预培养

将临床收集的非小细胞肺癌组织用无菌磷酸盐缓冲液冲洗后切成1-2mm³的组织块，然后加入肿瘤浸润性淋巴细胞培养基,放入5％CO₂、37℃培养箱培养2-3天后弃组织块，肿瘤浸润性淋巴细胞继续培养，每隔2-3天添加新鲜培养基，培养10-14天后，收集细胞，离心后，弃上清液，然后用培养基重悬浮和洗涤细胞，得到预培养的肿瘤浸润性淋巴细胞；

S3.饲养细胞与肿瘤浸润性淋巴细胞的共培养

将S1制得的饲养细胞与S2制得的预培养的肿瘤浸润性淋巴细胞分别离心后，用培养基重悬浮及洗涤两次，然后加入AIM-V/TIL培养基中，同时添加IL-2及CD3/CD28抗体，放入5％CO₂、37℃培养箱进行培养，每隔2-3天添加新鲜培养基。

2.根据权利要求1所述的用于肿瘤浸润性淋巴细胞快速培养的饲养细胞的制备方法，其特征在于：所述S1中磷酸盐缓冲液与病人自体外周血按照体积比1：1-1.2稀释。

3.根据权利要求1所述的用于肿瘤浸润性淋巴细胞快速培养的饲养细胞的制备方法，其特征在于：所述S1中X-VIVO培养基中还添加40ng/mL的IL-2和200ng/mL的CD3/CD28抗体。

4.根据权利要求1所述的用于肿瘤浸润性淋巴细胞快速培养的饲养细胞的制备方法，其特征在于：所述S1中丝裂霉素C的终浓度为50μg/mL。

5.根据权利要求1所述的用于肿瘤浸润性淋巴细胞快速培养的饲养细胞的制备方法，其特征在于：所述S2中肿瘤浸润性淋巴细胞培养基包括1640培养基、10wt％人A/B血清、1wt％的青霉素/链霉素溶液、10mM的L-glutamine和10mM的2-mercaptoethanol。

6.根据权利要求1所述的用于肿瘤浸润性淋巴细胞快速培养的饲养细胞的制备方法，其特征在于：所述S3中按照S1制得的饲养细胞与S2制得的预培养的肿瘤浸润性淋巴细胞的细胞数目为200-230:1的比例加入AIM-V/TIL培养基中。

7.根据权利要求6所述的用于肿瘤浸润性淋巴细胞快速培养的饲养细胞的制备方法，其特征在于：所述AIM-V/TIL培养基由AIM-V培养基与肿瘤浸润性淋巴细胞培养基按照体积比为1:1制得。

8.根据权利要求7所述的用于肿瘤浸润性淋巴细胞快速培养的饲养细胞的制备方法，其特征在于：所述AIM-V/TIL培养基还添加5000U/mL IL-2及200ng/mL的CD3/CD28抗体。

9.根据权利要求1所述的用于肿瘤浸润性淋巴细胞快速培养的饲养细胞的制备方法，其特征在于：所述S3中待细胞密度达到2×10⁶cells/mL后，进行1:1的细胞传代；同时每周进行细胞计数1-2次。