[发明专利]MAP3K8基因敲除PK-15细胞系的构建方法及其应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及MAP3K8基因敲除PK‑15细胞系的构建方法及其应用。MAP3K8基因敲除的PK‑15细胞系PK‑15‑KO‑MAP3K8的保藏编号为CCTCC NO:C2019176。该细胞系的构建方法包括1：根据猪源MAP3K8基因序列分别设计两条sgRNA，将双链sg RNA与酶切后的lentiGuide‑EGFP载体连接得到重组慢病毒表达质粒lentiGuide‑EGFP‑MAP3K8‑sg RNA；2：将重组慢病毒表达质粒、病毒包装辅助质粒共转染PK‑15细胞；3：收集病毒液，过滤、超速离心浓缩纯化病毒；4：用感染复数MOI=30的慢病毒感染PK‑15细胞，然后用超速流式细胞分选系统进行单细胞分选；5：将分选得到的单克隆细胞进行扩大培养并测序鉴定。该细胞系能够促进FMDV和SVV增殖，提高病毒产量，可用于FMDV和SVV疫苗株的大规模细胞化培养和生产，并可为研究MAP3K8在病毒感染过程中的作用机制提供有力工具。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及MAP3K8基因敲除PK-15细胞系的构建方法及其应用。

背景技术

猪肾上皮细胞PK-15，来源于猪肾，中文名为猪肾上皮细胞。该细胞对多种病毒比较敏感，如猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)等，可应用于猪圆环病毒疫苗、猪细小病毒疫苗、猪瘟病毒疫苗等的制备。

TPL2是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，也被称为COT或MAP3K8，在未受刺激时TPL2与p105和ABIN2形成复合物以保持非活性状态(Gantke,T.,S.Sriskantharajah,andS.C.Ley,Regulation and function of TPL-2,an IkappaB kinase-regulated MAPkinase kinasekinase.Cell Res,2011.21(1):p.131-45.)。当受到刺激后能通过TLR，TNFR和IL1R等多种受体激活下游ERK、JNK、p38和NF-κB等多种信号转导途径；还能刺激巨噬细胞、树突状细胞、嗜中性粒细胞等多种先天性免疫细胞产生IFN-γ，TNF-α等大量细胞因子(Gantke T,S.S.,Sadowski M,Ley SC.,IκB kinase regulation of the TPL-2/ERK MAPKpathway.2012.)。TPL2在调节CD4+T细胞分化产生不同Th细胞谱系的过程中也是必不可少的，是先天性免疫、炎症和肿瘤的重要参与者。

CRISPR-Cas9基因编辑技术是继ZFN和TALEN技术之后迅速发展起来的第三代基因组编辑技术。该技术来源于细菌和古细菌中存在抵抗噬菌体入侵的CRISPR-Cas获得性免疫系统，后经人工改造而逐渐发展起来(四川农业大学李沛哲.CRISPR/Cas9技术的发展与应用[N].科学导报,2019-08-20(B02).)。细菌在CRISPR和Cas9的帮助下，可以经由小RNA分子的引导，靶标和沉默入侵者遗传信息的关键部分。CRISPR-Cas9基因组编辑技术是通过一段gRNA特异性识别靶基因序列，并引导Cas9核酸内切酶在靶定位点剪切双链DNA，随后，细胞的非同源末端连接修复机制(NHEJ)重新连接断裂处的基因组DNA，并引入插入或缺失突变。与ZFN和TALEN技术相比，CRISPR-Cas9系统的基因编辑效率更高，Cas9系统的载体构建与使用也更加便捷，并已应用在各物种中，是目前使用最广泛的基因编辑技术。

发明内容

本发明利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建敲除MAP3K8基因的PK-15细胞系PK-15-KO-MAP3K8，该细胞系能够促进口蹄疫病毒(FMDV)和塞尼卡谷病毒(SVV)的增殖，提高病毒产量。可用于FMDV和SVV疫苗株的大规模细胞化培养和生产，并可为研究MAP3K8在病毒感染过程中的作用机制提供有力工具。

第一方面，本发明提供的敲除MAP3K8基因的PK-15细胞系PK-15-KO-MAP3K8，其保藏编号为CCTCC NO:C2019176。