[发明专利]MAP3K8基因敲除PK-15细胞系的构建方法及其应用

权利要求书

1.敲除MAP3K8基因的PK-15细胞系PK-15-KO-MAP3K8，其特征在于，所述PK-15细胞系PK-15-KO-MAP3K8的保藏编号为CCTCC NO: C2019176。

2.敲除MAP3K8基因的PK-15细胞系PK-15-KO-MAP3K8的构建方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

步骤1：引物设计与质粒构建：根据猪源MAP3K8基因序列，分别设计两条sgRNA，将双链sg RNA与酶切后的lentiGuide-EGFP载体进行连接，得到重组慢病毒表达质粒lentiGuide-EGFP-MAP3K8-sg RNA；

步骤2：质粒转染：将lentiGuide-EGFP-MAP3K8-sg RNA慢病毒表达质粒、病毒包装辅助质粒共转染PK-15细胞；

步骤3：慢病毒浓缩：收集病毒液，过滤、超速离心浓缩纯化病毒，保存备用；

步骤4：慢病毒感染及流式分选：用感染复数MOI= 30的慢病毒感染PK-15细胞，然后用超速流式细胞分选系统进行单细胞分选；

步骤5：单克隆细胞的培养及测序鉴定：将分选得到的单克隆细胞进行扩大培养并测序鉴定单细胞克隆。

3.根据权利要求2所述的敲除MAP3K8基因的PK-15细胞系PK-15-KO-MAP3K8的构建方法，其特征在于，所述sgRNA的序列为：

P-MAP3K8-sgRNA1 Forward：5’-CACCGTTCCATAATGTCTATTACAT-3’，

P-MAP3K8-sgRNA1Reverse：5’-AAACATGTAATAGACATTATGGAAC-3’；

P-MAP3K8-sgRNA2Forward：5’-CACCGAGATCCCAGATTCCTGGGGT-3’，

P-MAP3K8-sgRNA2Reverse：5’-AAACACCCCAGGAATCTGGGATCTC-3’；步骤1中所述lentiGuide-EGFP载体使用BsmBⅠ酶进行酶切后与sg RNA进行连接。

4.敲除MAP3K8基因的PK-15细胞系PK-15-KO-MAP3K8在病毒感染作用机制研究中的应用。

5.根据权利要求4所述的敲除MAP3K8基因的PK-15细胞系PK-15-KO-MAP3K8在病毒感染作用机制研究中的应用，其特征在于，所述病毒为FMDV或SVV。

6.敲除MAP3K8基因的PK-15细胞系PK-15-KO-MAP3K8在分离和培养FMDV或SVV中的应用。

7.敲除MAP3K8基因的PK-15细胞系PK-15-KO-MAP3K8在FMDV或SVV疫苗株的大规模细胞化培养和生产中的应用。