[发明专利]一种表达质粒、用于包装容量增加的二代腺病毒的细胞株及其应用

说明书

本发明公开了一种表达质粒、一种用于包装容量增加的二代腺病毒的细胞株及其应用。本发明的细胞株于2019年05月08日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201996，分类命名是人胚肾转化细胞AY293‑TD‑37。本发明的细胞株包含腺病毒的E2a‑DBP基因和E4‑ORF6基因，能够用于包装E2a‑DBP基因和E4基因缺失的二代腺病毒而形成完整的具有感染性的二代腺病毒颗粒，该二代腺病毒与第一代腺病毒相比，出现RCA的几率大大降低，为制备活载体疫苗奠定了基础，并且由于E2a‑DBP和E4基因的同时缺失使得包装容量相较与E2a突变或E4缺失的二代腺病毒再次增加，进一步提高了腺病毒载体外源基因的插入量，对增强腺病毒载体的应用水平具有重要意义。

技术领域

本发明属于基因治疗和重组疫苗领域，具体涉及一种表达质粒、用于包装容量增加的二代腺病毒的细胞株及其应用。

背景技术

腺病毒载体具有宿主范围广、基因转移效率高、稳定、安全、易操作等优点，是基因转移、基因治疗领域最为重要的病毒载体之一。腺病毒基因组含有4个早期转录元，分别为E1(E1a和E1b)、E2(E2a和E2b)、E3和E4，编码病毒的调节蛋白，以及5个晚期转录元L1～L5，编码晚期表达的病毒结构蛋白。腺病毒的基因组约为36000bp，整个基因组被分为100个基因图距单位，基因组的5＇端和3＇端各有长100-150bp的反向末端重复序列(ITR)，在其左端ITR 3＇端为长约300bp的包装信号Ψ，ITR及包装信号Ψ是腺病毒基因组复制和包装不可缺少的顺式作用元件，其长度不到1kb，除此以外的病毒基因组都可以被置换，其功能可用反式作用提供补偿。要在腺病毒中插入外源基因，必须缺失一段腺病毒基因组，缺失位点一般有E1、E3及E4与末端反向重复序列(ITR)之前的区域。

现有的腺病毒载体根据病毒基因的置换程度分为三代。第一代腺病毒载体为缺失E1和/或E3区，外源基因片段最多可插入6kb。第二代腺病毒载体为缺失E1、E3的基础上将E2a突变或者缺失E4，最大包装容量为9kb。第三代腺病毒载体为辅助依赖型腺病毒载体，缺失所有的编码序列，只含有两端的ITR和包装信号Ψ，插入外源基因可达36kb。这些腺病毒载体由于病毒基因组内非必需区域缺失，插入外源基因后，必须由反式作用提供补偿。反式补偿方式有两种，一种是由辅助病毒提供反式补偿，即辅助病毒依赖型，腺病毒基因片段可缺失相当一部分；另一种是由辅助包装细胞提供反式补偿，即由互补的细胞系提供反式补偿，比如第一代腺病毒载体需要293细胞系、911细胞系以及PERC6细胞系等，这些细胞系可以反式提供E1区的蛋白功能，使E1区缺失的腺病毒载体增殖并产生成熟的腺病毒颗粒。

第一代腺病毒载体由于病毒滴度高、感染效率高及制备简单等优点，使其在基因治疗领域备受青睐，但是，第一代腺病毒载体与表达E1蛋白的293细胞之间存在同源序列，通过重组，可重新获得E1区，导致产生可复制的腺病毒(RCA，replication-competentadenovirus)，由于RCA具有复制能力，在腺病毒的包装过程中一旦出现，就可能呈现优势生长，它不但影响载体病毒的产量，也为腺病毒噬菌斑的筛选纯化带来困难。另一方面，研究发现当以较高的MOI(感染复数，病毒/细胞Multiply Of Infection)感染细胞时，E2区对E1区功能上的依赖可以被忽略，病毒仍可以复制并表达晚期基因。另外，第一代非增殖型腺病毒载体最多只能装载约8kb的外源基因，这对于许多基因治疗方案来说仍是远远不够的。

因此，第二代腺病毒载体的应用尤为重要，其引起的宿主抗病毒免疫反应与第一代相比较要弱很多，因此在靶细胞中更稳定，目的基因的表达的时间也更长。同第一代腺病毒载体一样，

第二代腺病毒载体的包装依赖于辅助细胞(或)病毒提供其所缺失的反式作用元件，研究人员已经建立了多个细胞株用作第二代腺病毒载体的辅助细胞系，如可表达E2a区的DNA结合蛋白(DBP，DNA Binding protein)、E2b区的DNA聚合酶、E2b编码的末端蛋白以及可表达全部或大部分E4区蛋白的细胞株，而研发一种能够大规模生产高容量第二代腺病毒载体的特异性细胞系仍然是目前增强腺病毒载体临床应用水平的理想解决方案。