[发明专利]羧基磁珠偶联修饰的核酸探针及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种羧基磁珠偶联修饰的核酸探针及其制备方法和应用。该制备方法包括：羧基磁珠进行活化获得活化后的羧基磁珠；活化后的羧基磁珠与氨基修饰的核酸探针于偶联反应液中共孵育，得到羧基磁珠偶联修饰的核酸探针；所述偶联反应液为吗啉乙磺酸与N,N‑二甲基乙酰胺的混合溶液。将该羧基磁珠偶联修饰的核酸探针用于靶向捕获生物样品中的靶标核酸，靶向捕获的核酸能够满足基因突变检测和基因甲基化检测的需求，且能够避免生物样品中背景基因和抑制剂带来的影响，捕获效率高；能够在血液、尿液、粪便等DNA/RNA低丰度样本中靶向捕获特定基因。

技术领域

本发明属于核酸靶向捕获技术领域，涉及一种羧基磁珠偶联修饰的核酸探针及其制备方法和应用。

背景技术

结直肠癌是世界第三大恶性肿瘤。据世界卫生组织统计，全世界结直肠癌的年发病率为120万，结直肠癌年死亡率约为60万。在中国，结直肠癌的发病率和死亡率有逐年升高的趋势，据统计每年中国结直肠癌新发病例约37万，死亡病例接近20万。导致结直肠癌死亡率居高不下的关键因素之一是结直肠癌诊断发现时80％以上已经是中晚期；早期结直肠癌患者手术5年生存率超过90％，中晚期患者手术后5年生存率不足10％。因此结直肠癌早期发现和诊断非常重要。

研究表明结直肠癌是基因遗传和表观遗传变异逐渐积累的结果，例如DNA突变和甲基化，这些变异的累积导致正常结肠上皮细胞向癌细胞转化，因此DNA分子诊断对结直肠癌的早期发现具有非常重要的意义。目前SEPT9甲基化检测已经通过FDA和CFDA的批准，用于结直肠癌患者的血液筛查，对于结直肠癌患者的灵敏度超过70％，但是对早期腺瘤的检出率有限；而DAVIDA.AHLQUIST通过粪便DNA检测结直肠癌和腺瘤，发现粪便DNA能够检出92.3％的结直肠癌患者和42.4％的腺瘤(1cm以上)患者。这些研究表明粪便DNA检测更适用于结直肠癌和癌前病变的检测。

粪便样本中人源DNA含量所占比例较低，每克粪便样本中约为100ng的人源DNA，占比约为0.01％，其余绝大部分DNA来自肠道菌和食物残渣，导致对检测人源DNA中某靶标基因的背景干扰很大；然而要从粪便样本中得到高质量的DNA进行相应的研究还有很多问题需要解决，例如样本中DNA的稳定性，粪便中各种PCR抑制剂(多糖、胆酸等)。为了得到稳定可靠的样本进行研究，国内也出现了很多方法，大多是通过多步骤提纯和扩增来优化粪便DNA的质量。然而大多数研究方法操作繁琐且耗时较长，市场上一些粪便DNA提取试剂盒价格也比较昂贵。因此迫切需要一种能够从粪便样本中提取高质量DNA的方法来进行结直肠癌分子诊断和早筛相关的研究。

磁珠又称磁性微粒，是一类直径在纳米或微米级的球形复合材料。通常由磁性核，壳层及表面修饰集团组成。磁性核(氧化铁、四氧化三铁等)一般在纳米尺度并赋予磁颗粒超顺磁性，即在有外磁场作用时，磁颗粒显示出强磁性；当撤去外磁场时，磁颗粒不显磁性。壳层通常为无机物(氧化硅等)、表面活性剂(CTAB等)或高分子聚合物(聚苯乙烯、聚乙二醇等)。最外层是功能基层，在磁颗粒表面进行各种功能基团的修饰，如氨基，羧基，羟基等。

磁珠的超顺磁性，在外加磁场作用下能够拖拽目标物质向磁场方向移动，从而达到分离的目的，最外层的化学官能团可以与蛋白质或者核酸等生物分子偶联。该方法广泛用于细胞分离与纯化、细胞分型、免疫检测、核酸分离、靶向释药系统等领域。

羧基磁珠是最外层具有羧基功能团(-COOH)的磁珠，是常用的一种磁珠。目前羧基磁珠与核酸探针偶联的方法较少，且活化剂的选择、活化条件、偶联条件及偶联工艺上的差异，导致偶联探针效果差，影响实际应用。

发明内容