[发明专利]羧基磁珠偶联修饰的核酸探针及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种羧基磁珠偶联修饰的核酸探针的制备方法，其包括以下步骤：

羧基磁珠进行活化获得活化后的羧基磁珠；

活化后的羧基磁珠与氨基修饰的核酸探针于偶联反应液中共孵育，得到羧基磁珠偶联修饰的核酸探针；

所述偶联反应液为包含吗啉乙磺酸与N,N-二甲基乙酰胺的混合溶液；

优选地，所述核酸探针为DNA探针。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述吗啉乙磺酸与所述N,N-二甲基乙酰胺的体积比为1:10～10:1；

优选地，所述N,N-二甲基乙酰胺在所述偶联反应液的体积含量为50％～60％；

优选地，所述吗啉乙磺酸的浓度为0.05～0.1M，pH值≥7.0；

优选地，进行偶联反应的温度为22℃～37℃，时间为4～16h；

进一步优选地，进行偶联反应的温度为25℃～30℃，时间为10-12h。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述氨基修饰的核酸探针为伯氨基探针，所述伯氨基探针为核酸探针5’端用伯氨基修饰的一段核酸，长度为20～50bp；

优选地，所述活化的羧基磁珠和所述偶联反应液的体积比为10:100。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，羧基磁珠进行活化的方法为：

将羧基磁珠与活化剂在共孵育体系中进行共孵育，得到活化后的羧基磁珠；

其中，共孵育体系为pH值为4.5～5.5、浓度为0.05-0.1M的吗啉乙磺酸，所述羧基磁珠、所述活化剂、所述共孵育体系的体积比为1:10:10；

优选地，进行共孵育的温度为22℃～37℃，时间为10～60min；

进一步优选地，进行共孵育的温度为25℃～30℃，时间为15-25min。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述活化剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的混合物，或者所述活化剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的混合物；

优选地，所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔浓度比为9:1；所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的摩尔浓度比为9:1；

进一步优选地，所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的初始浓度为56.25mM，所述N-羟基琥珀酰亚胺的初始浓度为6.25mM，所述N-羟基硫代琥珀酰亚胺的初始浓度为6.25mM。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，还包括对羧基磁珠偶联修饰的核酸探针采用洗涤液进行洗涤除去多余氨基修饰的核酸探针，并将该羧基磁珠偶联修饰的核酸探针置于保存液中进行保存；

优选地，每L洗涤液中包括25mmol三羟甲基氨基甲烷、150mmol的NaCl和0.005L的吐温-20；该洗涤液的pH值为7.2～7.5；

优选地，所述保存液为pH值为8.0、浓度为0.5mM的三羟甲基氨基甲烷；保存条件为4℃～20℃，优选为4℃～10℃。

7.权利要求1-6任一项所述方法制备得到的羧基磁珠偶联修饰的核酸探针；

优选地，所述核酸探针为DNA探针。

8.权利要求7所述羧基磁珠偶联修饰的核酸探针在捕获生物样品中特异核酸片段中的应用；

优选地，所述生物样品包括粪便、血液、血浆和尿液；

优选地，所述特异核酸片段包括DNA或RNA。