[发明专利]一种低质量FFPE DNA的处理方法、装置和存储介质

说明书

本申请公开了一种低质量FFPE DNA的处理方法、装置和存储介质。本申请的处理方法包括，对FFPE DNA进行片段化处理，然后加热去除二级结构，再酶切消化；消化后末端修复、加poly A尾，并使用A碱基连接头；然后，进行PCR扩增，杂交捕获、测序，获得测序数据；将测序数据比对到人参考基因组，并从比对结果中过滤掉同时部分比对到同一染色体两个不同地方，且比对起始位置距离小于500bp的序列。本申请的方法，通过加热和酶切消化，消除大部分单链，使其不能相互连接后在末端补平中形成稳定双链，减少了因单链残留造成后续突变检测的假阳性；通过数据比对和过滤，进一步去除单链干扰，提高了突变检测结果的准确性。

技术领域

本申请涉及FFPE样本处理领域，特别是涉及一种低质量FFPE DNA的处理方法、装置和存储介质。

背景技术

福尔马林固定石蜡包埋(Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded，缩写FFPE)的样本，即FFPE样本。福尔马林固定石蜡包埋是组织样品常规采用的保存方法，该方法在临床和科研领域的应用已有一个世纪。数量巨大的归档FFPE样本是回顾性研究、阐明疾病机制、发现治疗靶标和指示预后的宝贵实验材料。FFPE样本中的DNA(以下简称FFPE DNA)经过了福尔马林处理容易发生交联、高温浸蜡、高温解交联等，并且长期保存后，容易发生严重的断链、单链化、无碱基位点、氧化损伤等，导致基因组不完整，这类样本称为低质量FFPE样本，其DNA称为低质量FFPE DNA。研究显示，低质量FFPE样本或低质量FFPE DNA至少占临床样本的1/10。低质量FFPE DNA通常建库效率低、测序数据不佳，具体体现在突变个数比正常FFPE样本多出数倍。国际主流品牌的FFPE建库试剂盒，例如KAPA Hyper Prep Kit(KAPA)、Ultra II DNA Library Prep(Illumina)、GeneRead Library Prep Kits(Qiagen)、2S DNA librAry Kits(Swift biosciences)、NEXTflex RapidDNA-Seq Kit(Bioo scientific)，以及国内FFPE建库试剂盒Rapid Plus DNA Lib Prepkit等产品在打断以后末端修复的过程中，尝试对低质量FFPE DNA的损伤进行修复以降低假阳性突变的检测。但是低质量FFPE DNA样本中的单链残留、茎环结构、打断后单链区域互补配对的二聚体产物等，在这些产品的末端修复过程中并不会被消除，因而继续进入到建库测序，继而在测序结果中出现Watson和Crick链信息同时出现在一条read上的正向+反向序列嵌合现象，导致变异检测中产生大量的假阳性位点。现有的建库试剂盒或文库构建方法都没有提供配套的解决方案，也没有给出采取怎样的措施消除这种影响的建议。

因此，如何解决低质量FFPE样本中单链残留、茎环结构、打断后单链区域互补配对形成二聚体产物等造成的假阳性突变检测结果，是本领域的研究重点和难点。

发明内容

本申请的目的是提供一种改进的低质量FFPE DNA的处理方法、装置和存储介质。

为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：

本申请的第一方面公开了一种低质量FFPE DNA的处理方法，其包括以下步骤：

片段化处理步骤，包括对提取的FFPE DNA进行片段化处理，获得片段化的DNA样本；

加热和消化处理步骤，包括对片段化的DNA样本进行加热，去除DNA的二级结构，然后再进行酶切消化；

末端修复和加接头步骤，包括对加热和消化处理步骤的产物进行末端修复，并加A尾，然后使用添加的A碱基连接接头；

文库构建步骤，包括对末端修复和加接头步骤的产物进行PCR扩增；

测序步骤，包括对文库构建步骤的产物进行杂交捕获，并对杂交捕获产物进行高通量测序，获得测序数据；