[发明专利]一种水稻原生质体分离与转化方法

说明书

本发明公开了一种水稻原生质体分离与转化方法。涉及原生质体分离转化技术领域。分离方法为取水稻苗茎部和叶片制备成薄片，酶解，过筛，弃滤液，留残存的薄片；将酶解后残存的薄片用W5溶液洗脱回收，震荡，过筛收集滤液，将收集的全部滤液混合，离心，弃上清，得沉淀，和W5溶液重悬，离心弃上清，和MMg溶液混合。转化方法为将目标载体和原生质体悬浊液混匀，和PEG混匀，水浴，和W5溶液混合，并终止反应，离心，弃上清，再和W5溶液混合，转到入细胞培养板，避光培养。本发明能够较好地获得高质量水稻原生质体，并将其应用于后续研究。

技术领域

本发明涉及原生质体分离转化技术领域，更具体的说是涉及一种水稻原生质体分离与转化方法。

背景技术

原生质体指在人为条件下，去除原有细胞壁或抑制新生细胞壁后所得到的仅有一层细胞膜包裹着的圆球状对渗透敏感的细胞。

目前，水稻原生质体是一种非常好的瞬时表达系统，已被广泛应用于植物生理生化和分子机制的研究，包括细胞信号转导过程，离子转运，细胞壁合成，蛋白质分泌以及细胞程序化死亡等生物学过程。基于原生质体的实验技术主要包括亚细胞定位，基因瞬时表达分析，启动子活性分析，离子吸收实验以及蛋白质相互作用验证。

但是水稻原生质体在制备过程中通常表现为分离率低、破裂率高、杂质多等缺点，影响水稻的进一步研究。

如何制备高质量水稻原生质体相关报道少见。

因此，提供一种水稻原生质体分离与转化方法，提高效率与质量是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种水稻原生质体分离与转化方法

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种水稻原生质体分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取水稻苗茎部和叶片制备成0.4-0.6mm薄片，将所述薄片和酶液按质量体积比1g:10-15ml混合，避光，25-30℃摇床，转速50rpm，酶解2.5-3.5h后，过300-400目筛，弃初滤液，留残存的薄片；

选择茎部或叶片制备薄片(其细胞较小、质量佳)，置于250ml三角瓶中，铺满三角瓶底部；加入25-50ml酶液，三角瓶需用锡箔纸包住，避免见光；优选28℃摇床；优选360目筛；

(2)将步骤(1)残存的薄片用40-60ml W5溶液洗脱回收，再用力震荡8-12s、过300-400目筛收集滤液，并重复收集4-6次；

W5溶液用量为40-60ml，优选50ml；将残存的薄片洗脱回收至新的三角瓶中，用力震荡10s左右，此时便可将质量佳的原生质体裂解出来，并重复；

(3)将步骤(2)收集的滤液各自通过水平转子200-300g离心3-4min，弃上清，留沉淀混匀，得原生质体A；

优选水平转子250g离心3min，离心升降速设为1；

(4)将步骤(3)所述原生质体A和10-20ml W5溶液混合，重悬所述原生质体A，水平转子400-500g离心3-4min，弃上清，得原生质体B，原生质体B和1ml MMg溶液混合，得原生质体悬浊液。

W5溶液优选10-20ml，进一步优选为15ml；优选水平转子450g，离心3min；得到的原生质体悬浊液用显微镜观察原生质体的裂解效果，其中，质量佳的批次可直接用于单细胞测序。

优选的：水稻苗来源：取水稻种子于35-40℃浸泡20-30h，再将浸泡后的种子置于25-30℃，暗培养催芽12-20d，每天用清水换液。

优选的：于37℃浸泡24h，再将浸泡后的种子置于30℃培养箱中，暗培养催芽。