[发明专利]一种水稻原生质体分离与转化方法

权利要求书

1.一种水稻原生质体分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取水稻苗茎部和叶片制备成0.4-0.6mm薄片，将所述薄片和酶液按质量体积比1g:10-15ml混合，避光，25-30℃摇床，转速50rpm，酶解2.5-3.5h后，过300-400目筛，弃初滤液，留残存的薄片；

(2)将步骤(1)所述残存的薄片用40-60mlW5溶液洗脱回收，再用力震荡8-12s、过300-400目筛收集滤液，并重复收集4-6次；

(3)将步骤(2)收集的滤液各自通过水平转子200-300g离心3-4min，弃上清，留沉淀混匀，得原生质体A；

(4)将步骤(3)所述原生质体A和10-20mlW5溶液混合，重悬所述原生质体A，水平转子400-500g离心3-4min，弃上清，得原生质体B，原生质体B和1mlMMg溶液混合，得原生质体悬浊液。

2.如权利要求1所述的一种水稻原生质体分离方法，其特征在于，所述水稻苗来源：取水稻种子于35-40℃浸泡20-30h，再将浸泡后的种子置于25-30℃，暗培养催芽12-20d，每天用清水换液。

3.如权利要求1所述的一种水稻原生质体分离方法，其特征在于，所述酶液每100ml包括0.6MD-Mannitol2.74g、10mMMES0.05g、1.5％CellulaseR-100.38g和0.75％Macerozyme0.19g，0.1％BSA0.03g、3.4mMCaCl₂0.01g和200mg/mlCarbenicillin6.25μl。

4.如权利要求3所述的一种水稻原生质体分离方法，其特征在于，所述酶液制备方法：先将0.6MD-Mannitol、10mMMES、1.5％CellulaseR-10和0.75％Macerozyme混合，在55℃水浴至全部溶解；再用1MKOH调pH至5.7，过0.22μm滤膜除菌；最后冷却至室温加入0.1％BSA、3.4mMCaCl₂和200mg/ml Carbenicillin6.25μl，得酶液。

5.一种水稻原生质体转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将目标载体和权利要求1所述的原生质体悬浊液按照质量体积比为1-2μg：20μl混匀，使细胞终浓度为1-5×10⁶cell/ml，得悬浊液A；

(2)将所述悬浊液A和PEG溶液按照体积比10：11迅速混匀，得悬浊液B；

(3)将所述悬浊液B经25-30℃水浴10-20min，再和W5溶液按体积比7:60混匀，待终止反应得悬浊液C；

(4)将所述悬浊液C水平转子250-350g离心3-4min，得悬浊液D；

(5)将所述悬浊液D弃上清，得悬浊液E，再和750μlW5溶液混匀，转入细胞培养板，于25-30℃避光培养6-12h,最终获得成功表达目的基因的原生质体细胞。

6.如权利要求5所述的一种水稻原生质体转化方法，其特征在于，所述目标载体为：使用Qiagen中量提取试剂盒获得100-150μg的高纯度无内毒素的质粒，定量稀释到2μg/μl。

7.如权利要求5所述的一种水稻原生质体转化方法，其特征在于，所述PEG溶液体积浓度为40％，每100mlPEG溶液成分包括0.6MD-Mannitol10.93g；100mMCaCl₂1.11g；40％(v/v)PEG400040g。