[发明专利]一种高效合成高纯度透明质酸及其寡聚糖的重组谷氨酸棒状杆菌

权利要求书

1.一种谷氨酸棒杆菌，其特征在于，在谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032的基础上，敲除胞外多糖cg0420和/或cg0424的编码基因，并表达如SEQ ID NO.3所示的透明质酸合酶，并过表达SEQ ID NO.10所示的透明颤菌来源的血红蛋白VHb，并强化UDP-N-乙酰葡萄糖胺和UDP-葡萄糖醛酸途径；所述cg0420的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述cg0424的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述UDP-N-乙酰葡萄糖胺途径包括：谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶、磷酸葡萄糖变位酶、UDP-N-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶/葡萄糖-1-磷酸乙酰转移酶双功能酶；所述UDP-葡萄糖醛酸途径包括：磷酸葡萄糖变位酶、葡萄糖-6-磷酸尿酰胺转移酶、UDP-葡萄糖脱氢酶。

2.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述磷酸葡萄糖变位酶的基因序列如SEQ ID NO.4所示，所述葡萄糖-6-磷酸尿酰胺转移酶的基因序列如SEQ ID NO.5所示，所述UDP-葡萄糖脱氢酶的基因序列如SEQ ID NO.6所示，所述谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶的基因序列如SEQ ID NO.7所示，所述磷酸葡萄糖变位酶的基因序列如SEQ ID NO.8所示，所述UDP-N-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶/葡萄糖-1-磷酸乙酰转移酶双功能酶GlmU的基因序列如SEQ ID NO.9所示。

3.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，将编码UDP-N-乙酰葡萄糖胺和/或UDP-葡萄糖醛酸途径的基因及编码血红蛋白VHb的基因与载体连接，在谷氨酸棒杆菌中表达；所述载体包括以下任一种：pXMJ19、pECXK99E、pEC-XT99A、pEKEx1、pEKEx2、pVWEx1、pVWEx2、pZ8-1、pECTAC-K99、pAPE12。

4.构建权利要求1~3任一所述谷氨酸棒杆菌的方法，其特征在于，步骤包括：（1）通过构建敲除框，分步或同时敲除胞外多糖合成基因cg0420和cg0424；（2）将编码透明质酸合酶的基因、编码血红蛋白VHb的基因及pgM，ugd，galU，glmS，glmM，glmU中的至少一个基因与载体连接，并转化至谷氨酸棒杆菌细胞中。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法是将pgm、galU、ugd与载体pXMJ19连接。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法是将glmS、glmM、glmU与载体pECXK99E连接。

7.一种生产透明质酸的方法，其特征在于，应用权利要求1~3任一所述谷氨酸棒杆进行发酵；所述发酵是在含有碳源、氮源、无机盐、金属离子和氧气培养环境中，于25~35℃发酵24-72 h。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在发酵的前期添加透明质酸水解酶或者透明质酸裂解酶；所述的透明质酸水解酶或者透明质酸裂解酶的添加量为500-50000U/mL。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，发酵过程补加葡萄糖。

10.权利要求1~3任一所述谷氨酸棒杆菌在制备透明质酸方面的应用。