[发明专利]一种高效合成高纯度透明质酸及其寡聚糖的重组谷氨酸棒状杆菌

说明书

本发明公开了一种高效合成高纯度透明质酸及其寡聚糖的重组谷氨酸棒状杆菌，属于生物工程技术领域。本发明构建的重组谷氨酸棒状杆菌生产的透明质酸的产量达到40g/L，粗产品纯度达到95％。通过外源添加透明质酸水解酶并优化发酵条件，可以获得特定分子量的透明质酸寡糖，并实现透明质酸产量的进一步提升，使产量达到72g/L。本发明为微生物高效合成高纯度透明质酸奠定了坚实的基础，构建的重组谷氨酸棒状杆菌适合于工业化生产应用。

技术领域

本发明涉及一种高效合成高纯度透明质酸及其寡聚糖的重组谷氨酸棒状杆菌，属于生物工程技术领域。

背景技术

透明质酸是由N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸组成的双糖单位聚合而成的直链酸性黏多糖。超高分子量透明质酸具有较好的粘弹性，保湿性和抑制炎性等功能，可用于眼科手术中的粘弹剂和用于关节腔内注射治疗等。高分子量透明质酸具有良好的保湿，润滑的作用可被用于化妆品领域。高纯度的透明质酸和透明质酸寡糖具有抗肿瘤，促进伤口愈合，促进骨和血管生成，免疫调节等作用。2016年全球有72亿美元的透明质酸市场，预测2020年全球额达到108亿美元。

目前市场上的透明质酸来源主要通过天然产透明质酸菌株兽疫链球菌发酵生产获得。但由于兽疫链球菌是致病菌株，能够引起许多疾病，所以生产的透明质酸难以满足医药，食品等邻域的要求，此外生产的透明质酸纯度低，降低产品的品质。为了解决这方面的问题，人们利用基因工程技术在一些工程菌株中异源表达透明质酸合酶来合成透明质酸，比如枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌。但是枯草芽孢杆菌本身容易发生细胞裂解，细胞裂解释放的DNA会造成透明质酸产品的污染，相比较而言谷氨酸棒杆菌细胞壁厚、耐受性强，有比枯草芽孢杆菌更好的细胞稳定性。但是谷氨酸棒杆菌会在细胞外合成较多的胞外多糖。这些多糖不但竞争透明质酸合成途径的底物，还增加下游透明质酸纯化的难度，降低透明质酸产品的品质。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种谷氨酸棒杆菌，沉默或敲除胞外多糖基因cg0420和/或cg0424，并表达透明质酸合酶；所述cg0420基因含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述cg0424含有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；所述透明质酸合酶为(a)、(b)或(c)所示：

(a)来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)且氨基酸序列与SEQ ID NO.3有至少90％同源性的酶；

(b)含有SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的酶；

(c)在(a)或(b)中经过取代或缺失且具有透明质酸合酶活性的由(a)或(b)衍生的蛋白质。

在一种实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌沉默或敲除胞外多糖基因cg0420(SEQ IDNO.1)和cg0424(SEQ ID NO.2)，并表达透明质酸合酶。

在一种实施方式中，所述透明质酸合酶(SEQ ID NO.3)来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)。

在一种实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌还强化UDP-N-乙酰葡萄糖胺和/或UDP-葡萄糖醛酸途径。

在一种实施方式中，所述UDP-N-乙酰葡萄糖胺途径包括：谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶、磷酸葡萄糖变位酶、UDP-N-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶/葡萄糖-1-磷酸乙酰转移酶双功能酶。

在一种实施方式中，所述UDP-葡萄糖醛酸途径包括：磷酸葡萄糖变位酶、葡萄糖-6-磷酸尿酰胺转移酶、UDP-葡萄糖脱氢酶。