[发明专利]检测细菌在丹参定殖能力的方法

权利要求书

1.一种检测细菌在丹参中定殖能力的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）将待检测细菌接种于灭菌处理后的丹参幼苗中培养以使所接种的细菌定殖；所述待检测菌种为Sp7和Sp245的Azospirillum菌；

2）将定殖好的丹参幼苗分别经过如下步骤处理并分组：

W）无菌水冲洗；

SD）灭菌的盐溶液洗涤10 min~30 min后再用无菌水冲洗；

B）依次用灭菌的盐溶液洗涤10 min~30 min、用3%~7% (g/100ml) 次氯酸钠洗涤1.5min~2.5min、用Na₂S₂O₃溶液冲洗；

其中，所述盐溶液包括以下组分：

127mM~147mM NaCl，1.7mM~3.7mM KCl，5mM~15mM Na₂HPO₄，1.3mM ~2.3mM KH₂PO₄，0.3mM~0.7mM MgSO₄，0.7mM~1.3mM CaCl₂，0.07%~0.13%（v/v）Triton-X100，且所述盐溶液pH=7.0~7.8；

3）扩增各分组中定殖好的所述待检测细菌的特征性核酸片段，并将扩增结果进行染色，根据W、SD和B组是否出现目标条带以确定所述待检测细菌的定殖能力，在B组出现目标条带定殖能力最强，SD组次之，W组最次；

所述细菌的特征性核酸片段为细菌的16S rDNA中的片段；

所述细菌的特征性核酸片段扩增所用上游引物和下游引物分别如SEQ ID NO:1和2所示。

2.根据权利要求1所述的检测细菌在丹参定殖能力的方法，其特征在于，所述方法还包括扩增丹参内源性表达稳定的基因作为内参基因的步骤。

3.根据权利要求2所述的检测细菌在丹参定殖能力的方法，其特征在于，所述丹参内源性表达稳定的基因为LEAFY基因。

4. 根据权利要求3所述的检测细菌在丹参定殖能力的方法，其特征在于，扩增所述LEAFY基因所用上游引物和下游引物分别如SEQ ID NO:3和4所示。

5.根据权利要求1~4任一项所述的检测细菌在丹参定殖能力的方法，其特征在于，所述灭菌处理后的丹参幼苗的制备方法包括：

将丹参种子培养发芽10~15天后得到所述丹参幼苗。

6.根据权利要求5所述的检测细菌在丹参定殖能力的方法，其特征在于，所述丹参种子经过灭菌清洗处理，所述灭菌清洗处理选自下列处理：

70%~85%的乙醇水溶液清洗、40%~60% (g/100ml)次氯酸钠清洗以及无菌水清洗。

7.根据权利要求5所述的检测细菌在丹参定殖能力的方法，其特征在于，所述丹参种子在培养发芽之前还经过低温春化处理：

于1/2 MS固体培养基中，0°C~8°C避光培养2~4天。

8. 根据权利要求7所述的检测细菌在丹参定殖能力的方法，其特征在于，所述培养发芽5~10天的培养条件为：光照培养12h~16h，温度23°C ~27°C，黑暗培养8h~12h，温度20°C ~24°C。