[发明专利]一种循环肿瘤细胞的分离培养方法及试剂盒

说明书

本发明公开一种循环肿瘤细胞的分离培养方法及试剂盒，所述方法包括以下步骤：取人体全血标本，采用密度梯度离心的方式，分离得到PBMC；将PBMC与基础培养液混合，离心，移除上清液，保留下层细胞液体；培养容器内放置有三维培养支架，将细胞液体转移至培养容器中的三维培养支架内，再加入细胞培养液；在第一天和第三天更换一次细胞培养液。以血液为标本，无需对肿瘤病患进行穿刺或手术取得肿瘤标本来进行分离培养，不仅降低病患标本取得风险，也缩短了肿瘤分离所需时间。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，主要涉及一种循环肿瘤细胞的分离培养方法及试剂盒。

背景技术

循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，）简称CTC，通常把进入人体外周血的肿瘤细胞称为循环肿瘤细胞。循环肿瘤细胞检测在乳腺癌、肺癌、结直肠癌及前列腺癌等转移性实体瘤的微转移、监测术后复发、疗效评估与预后及个体化靶向治疗等方面的有重要作用。将CTC捕获出来进行培养，进一步对其进行基因测序、mRNA表达和蛋白表达情况分析，为患者制定/调整治疗方案，达到个体化治疗目的。CTC的富集关键在于如何从复杂的血液环境中高效、迅速、准确地富集CTC。因为血液循环系统存在着数量巨大的血液细胞，包括红细胞、白细胞、血小板，而CTC在肿瘤患者外周血中数量稀少，平均10⁶～10⁷个白细胞中仅含有1个CTC。CTC的富集效果（尤其是富集效率）直接影响了对病人肿瘤诊断的预判以及后续的基因检测等。因此，目前针对循环肿瘤细胞的分离和培养方法还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种循环肿瘤细胞的分离培养方法及试剂盒，可以从血液中分离循环肿瘤细胞，旨在提供一种新的循环肿瘤细胞的分离培养方法，缩短循环肿瘤分离及培养所需要的时间进程。

本发明的技术方案如下：

一种循环肿瘤细胞的分离培养方法，其中，包括以下步骤：

（1）取人体全血标本，采用密度梯度离心的方式，分离得到PBMC；

（2）将PBMC与基础培养液混合，离心，移除上清液，保留下层细胞液体；

（3）培养容器内放置有三维培养支架，将细胞液体转移至培养容器中的三维培养支架内，再加入细胞培养液。

所述的循环肿瘤细胞的分离培养方法，其中，步骤（1）中，将人体全血标本与PBS以1:1~3混合得到稀释血液，取聚蔗糖置于离心管，缓慢披覆稀释血液于聚蔗糖的上层，并于15~25℃下，以350~450×g离心25~45分钟，取离心管中间白色层，即为PBMC；

步骤（2）中，用基础培养液打散PBMC，混合均匀后，以150~300×g离心3~8分钟；所述基础培养液为天然或人工合成培养基，所述基础培养液中添加至少一种天然或人工生长因子；

步骤（3）中，所述细胞容器采用细胞培养板，每孔内底部放置一片直径为3mm的三维培养支架；每片3mm的三维培养支架加入3~10μL细胞液体，再加入80~200μL细胞培养液；添加完细胞培养液之后，转入细胞培养箱，37℃，5~20% CO₂条件，进行培养；所述细胞培养液为天然或人工合成培养基，所述细胞培养液中添加至少一种天然或人工生长因子。

所述的循环肿瘤细胞的分离培养方法，其中，步骤（3）中，在添加完细胞培养液后，还包括以下步骤：

在孔盘外圈加入PBS。

所述的循环肿瘤细胞的分离培养方法，其中，所述循环肿瘤细胞的分离培养方法还包括以下步骤：

（4）在第一天和第三天更换一次培养基：先移除细胞培养液，再加入洗涤缓冲溶液，移除；最后添加新的细胞培养液。