[发明专利]一种循环肿瘤细胞的分离培养方法及试剂盒在审
| 申请号： | 201911013559.7 | 申请日： | 2019-10-23 |
| 公开（公告）号： | CN110628721A | 公开（公告）日： | 2019-12-31 |
| 发明（设计）人： | 魏勋斌;谢志强;陈建一 | 申请（专利权）人： | 佛山市璞狄医疗科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N5/09 | 分类号： | C12N5/09 |
| 代理公司： | 44377 佛山市海融科创知识产权代理事务所(普通合伙) | 代理人： | 陈志超;罗尹清 |
| 地址： | 528225 广东省佛山市南海区狮山镇321国道仙溪段广*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 细胞培养液 分离培养 培养容器 三维培养 细胞液体 病患 支架 标本 肿瘤 密度梯度离心 循环肿瘤细胞 基础培养液 人体全血 肿瘤标本 穿刺 上清液 试剂盒 移除 下层 血液 保留 | ||
1.一种循环肿瘤细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取人体全血标本，采用密度梯度离心的方式，分离得到PBMC；
（2）将PBMC与基础培养液混合，离心，移除上清液，保留下层细胞液体；
（3）培养容器内放置有三维培养支架，将细胞液体转移至培养容器中的三维培养支架内，再加入细胞培养液。
2.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤（1）中，将人体全血标本与PBS以1:1~3混合得到稀释血液，取聚蔗糖置于离心管，缓慢披覆稀释血液于聚蔗糖的上层，并于15~25℃下，以350~450×g离心25~45分钟，取离心管中间白色层，即为PBMC；
步骤（2）中，用基础培养液打散PBMC，混合均匀后，以150~300×g离心3~8分钟；所述基础培养液为天然或人工合成培养基，所述基础培养液中添加至少一种天然或人工生长因子；
步骤（3）中，所述细胞容器采用细胞培养板，每孔内底部放置一片直径为3mm的三维培养支架；每片3mm的三维培养支架加入3~10μL细胞液体，再加入80~200μL细胞培养液；添加完细胞培养液之后，转入细胞培养箱，37℃，5~20% CO2条件，进行培养；所述细胞培养液为天然或人工合成培养基，所述细胞培养液中添加至少一种天然或人工生长因子。
3.根据权利要求2所述的循环肿瘤细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤（3）中，在添加完细胞培养液后，还包括以下步骤：
在孔盘外圈加入PBS。
4.根据权利要求3所述的循环肿瘤细胞的分离培养方法，其特征在于，所述循环肿瘤细胞的分离培养方法还包括以下步骤：
（4）在第一天和第三天更换一次培养基：先移除细胞培养液，再加入洗涤缓冲溶液，移除；最后添加新的细胞培养液。
5.一种用于分离循环肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括梯度液、基础培养液、放置有三维培养支架的培养容器、细胞培养液、洗涤缓冲溶液。
6.一种循环肿瘤细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
（a）取人体全血标本，采用密度梯度离心的方式，分离得到PBMC；
（b）将PBMC与PBS混合，离心，移除上清液，保留下层细胞液体；
（c）在细胞液体中加入PBS，混合，离心，移除上清液，保留下层细胞液体；再加入PBS，打散细胞团块；
（d）在细胞液体中加入至少一种能辨识及结合循环肿瘤细胞表面抗原之荧光接合专一抗体与至少一种能辨识及结合白血球细胞表面抗原之荧光接合专一抗体，得到含抗体的细胞液体；
（e）经由流式细胞仪作为侦测并定量血液中之循环肿瘤细胞，分选有循环肿瘤细胞表面抗原且无白血球细胞表面抗原讯号之细胞族群；
（f）培养容器内放置有三维培养支架，将细胞液体转移至培养容器中的三维培养支架，再加入细胞培养液。
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