[发明专利]一种检测草酸浓度的试剂、试剂盒及方法

说明书

本发明涉及一种检测草酸浓度的试剂、试剂盒及方法，属于草酸检测领域；本发明基于四步偶联反应，利用草酰基辅酶A合成酶(AAE3)降解草酸(oxalate)生成一磷酸腺苷(AMP)的能力，依次为之后的三个反应提供底物，使其继续发生。此四步偶联反应最终导致反应体系中还原型辅酶I(NADH)被消耗，NADH在340nm处有吸收峰，340nm处吸光值的变化即能指示被降解草酸的浓度，该方法检出限低，线性范围宽，对样品需要量少。同时基于此方法制成的试剂及试剂盒成本低，且本发明可用于大规模样品的测定。

技术领域

本发明涉及草酸检测领域，更具体的涉及一种检测草酸浓度的试剂、试剂盒及方法。

背景技术

草酸是食物中普遍的抗营养因子，动物和人类体内的草酸几乎完全来源于食物，特别是通过果实、叶用蔬菜、谷类和豆类中来摄取。草酸代谢途径存在于细菌、真菌和植物中，但是不存在于包括人在内的脊椎动物中。因此，草酸一旦被摄取，就必须通过肾脏排出，因为胃肠道是不能排泄草酸的。当富含草酸的食物被大量食用后，就会引发原发性和继发性的草酸尿症，从而削弱肾功能，扰乱谷氨酸代谢以及减少血液凝固。因此，过量摄入草酸会导致一系列肾脏相关的失调症。同时，草酸的存在会减少钙离子在肠道中的吸收，从而形成草酸钙的沉淀，最终导致肾结石；而且，摄入的过量草酸会与铁、镁以及许多微量元素形成不溶解的盐，从而削弱人体对这些元素的利用。

目前，草酸的检测手段包括高效液相色谱、离子色谱等，但在检测过程中需要的仪器价格昂贵，时间长，同时还会存在干扰离子，灵敏度不高等缺陷。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种成本较低、灵敏度高、快速检测草酸浓度的试剂、试剂盒及方法，本发明的适用范围广泛，可用于测定各种水体，动植物和微生物的体液及浸提液中的草酸含量。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：一种检测草酸浓度的试剂，其特征在于，包括：100mM pH8.0的Tris-HCl缓冲溶液、浓度为1M的CoA溶液、5M的ATP溶液、1M的MgCl₂溶液、400mM的NADH溶液、100mM的PEP溶液、2KU的肌激酶、50mg的PEPK、25KU的LDH、0.5mg/mLAAE3。

进一步的，所述MgCl₂溶液为酶促反应的辅助因子。

进一步的，所述Tris-HCI缓冲溶液用来维持反应体系的pH值稳定。

进一步的，一种用于快速检测草酸浓度的试剂盒，所述试剂盒包括若干试剂瓶，每个试剂瓶中放置一种试剂，试剂包括浓度分别为100mM pH 8.0的Tris-HCI缓冲溶液、1M的CoA溶液母液、5M的ATP溶液母液、1M的MgCl₂溶液母液、400mM的NADH溶液母液、100mM的PEP溶液母液、以及2KU的肌激酶，50mg PEPK，25KU的LDH和0.5mg/mL的AAE3；

至少一瓶试剂瓶包括浓度为100mM pH8.0的Tris-HCI缓冲溶液；至少一瓶试剂瓶包括浓度为1M的CoA溶液母液；至少一瓶试剂瓶包括浓度为5M的ATP溶液母液；至少一瓶试剂瓶包括浓度为1M的MgCl₂溶液母液；至少一瓶试剂瓶包括浓度为400mM的NADH溶液母液，至少一瓶试剂瓶包括浓度为100mM的PEP溶液母液；至少一瓶试剂瓶包括浓度为2KU的肌激酶；至少一瓶试剂瓶包括50mg的PEPK；至少一瓶试剂瓶包括浓度为25KU的LDH；至少一瓶试剂瓶包括浓度为0.5mg/mL AAE3。

进一步的，一种用于检测草酸浓度的方法，包括以下步骤：

(1)取一排酶标管并编号，分别依次添加一系列具有体积梯度的所述草酸溶液；