[发明专利]一种检测草酸浓度的试剂、试剂盒及方法

权利要求书

1.一种检测草酸浓度的试剂，其特征在于，包括：100mM pH8.0的Tris-HCl缓冲溶液、浓度为1M的CoA溶液、5M的ATP溶液、1M的MgCl₂溶液、400mM的NADH溶液、100mM的PEP溶液、2KU的肌激酶、50mg的PEPK、25KU的LDH、0.5mg/mL的AAE3。

2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于：所述MgCl₂溶液为酶促反应的辅助因子。

3.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于：所述Tris-HCI缓冲溶液用来维持反应体系pH值的稳定。

4.一种基于权利要求1所述的试剂制成的用于检测草酸浓度的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括若干试剂瓶，每个试剂瓶中放置一种试剂，试剂包括浓度分别为100mM pH8.0的Tris-HCI缓冲溶液、1M的CoA溶液母液、5M的ATP溶液母液、1M的MgCl₂溶液母液、400mM的NADH溶液母液、100mM的PEP溶液母液、以及2KU的肌激酶，50mg PEPK，25KU的LDH和0.5mg/mL的AAE3；

至少一瓶试剂瓶包括浓度为100mM pH8.0的Tris-HCI缓冲溶液；至少一瓶试剂瓶包括浓度为1M的CoA溶液母液；至少一瓶试剂瓶包括浓度为5M的ATP溶液母液；至少一瓶试剂瓶包括浓度为1M的MgCl₂溶液母液；至少一瓶试剂瓶包括浓度为400mM的NADH溶液母液，至少一瓶试剂瓶包括浓度为100mM的PEP溶液母液；至少一瓶试剂瓶包括浓度为2KU的肌激酶；至少一瓶试剂瓶包括50mg的PEPK；至少一瓶试剂瓶包括浓度为25KU的LDH；至少一瓶试剂瓶包括浓度为0.5mg/mL的AAE3。

5.一种用于检测草酸浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取一排酶标管并编号，分别依次添加一系列具有体积梯度的所述草酸溶液；

(2)取离心管，依次加入955μLTris-HCl缓冲溶液，10μLMgCl₂溶液母液，0.5μL CoA溶液母液，5μL ATP溶液母液，10μL NADH溶液母液，10μL PEP溶液母液，并用1mL的枪头轻轻吹打混匀；向上述混匀的反应体系中分别添加10U的肌激酶，10U的PEPK，10U的LDH和1μL AAE3，并再次用1mL的枪头轻轻吹打混匀；

(3)向步骤(1)中编号的酶标管中分别依次添加步骤(2)已混匀的反应体系轻轻震荡混合，使混合后体积为100μL，即得具有浓度梯度的一系列草酸标准溶液；

(4)再另取三个酶标管编号，并分别加入不同体积待测底物，用步骤(2)中混匀的反应体系补加至100μL，轻轻震荡；

(5)用酶标仪测定步骤(4)中各个酶标管在340nm处的吸光值，每个酶标管同时读取4个数据，连续读取3次；反应10min后再次以相同的方式测定340nm处的吸光值；

(6)以草酸标准溶液的浓度为横坐标，NADH反应前后的吸光度之差为纵坐标绘制标准曲线，拟合线性方程，将待测样品溶液前后的吸光度之差带入线性方程即可计算出待测样品溶液中草酸的浓度。

6.根据权利要求5所述的草酸浓度检测方法，其特征在于：步骤(6)中所述待测样品溶液吸光值超出标准曲线的范围，则需要对样品进一步的稀释或者浓缩。

7.根据权利要求5所述的草酸浓度检测方法，其特征在于：所述草酰基辅酶A合成酶AAE3为经过诱导纯化的酶。

8.根据权利要求7所述的草酸浓度检测方法，其特征在于：所述草酰基辅酶A合成酶AAE3诱导纯化的步骤为:

(1)将番茄中编码草酰基辅酶A合成酶基因通过质粒导入大肠杆菌中，利用半乳糖酐酶IPTG进行诱导；

(2)再利用镍柱纯化诱导蛋白，使草酰基辅酶A合成酶富集纯化。