[发明专利]基于衍生化净化与反萃取富集技术分析鲜烟叶中烟碱异构体的方法

说明书

本发明公开了一种基于衍生化净化与反萃取富集技术分析鲜烟叶中烟碱异构体的方法，包括：烟碱异构体利用碱性二氯甲烷提取；(1S)‑(‑)‑莰烷酰氯衍生化净化去除降烟碱、新烟草碱与假木贼碱的干扰；盐酸溶液反萃取富集；将富集得到的烟碱异构体利用商业化的常规全多孔多糖衍生物AMP色谱柱与反相液相色谱‑紫外检测器体系进行定性与定量的分析检测。本发明与其它手性分析方法相比，具有简单快速、重复性好(RSD＜2％)、分离度(R_s≥1.60)与灵敏度高(R‑烟碱占比最低检测限0.01％)的优点，能高效的分析鲜烟叶中的烟碱异构体组成。

技术领域

本发明涉及一种基于衍生化净化与反萃取富集技术分析鲜烟叶中烟碱异构体的方法，属于烟碱异构体的分离与检测技术领域。

背景技术

烟草生物碱已经被广泛认为与烟草的品质密切相关，且也是特有亚硝胺的前体物质。烟草中含有大量相似结构的生物碱，最重要且含量相对较高的生物碱有烟碱，降烟碱，假木贼碱和新烟草碱。烤烟中一般烟碱占95％左右、降烟碱与新烟草碱占2-3％左右，甲木贼碱占0.3％左右。烟碱是烟草和烟气中含量最丰富的生物碱，能提供卷烟抽吸时的烟味、劲头和生理满足感，裂解产生吡啶类化合物，是吡啶类杂环化合物的前体，产生油树脂样的香气；烟碱及其衍生物还可以应用于低焦油卷烟的加香等。

烟碱分子含有一个手性中心，是四氢吡咯环上的1位碳原子，因此烟碱有两个对映体-S-(-)-烟碱(以下简称S-烟碱)与R-(+)-烟碱(以下简称R-烟碱)。对映异构体的物理化学性质都非常相似，但在代谢机制与生理活性上常常具有显著差异。例如，体外细胞和动物实验结果显示，S-烟碱的生理活性比R-烟碱更强，但R-烟碱有更强的致畸性。烟草中主要为S-烟碱，R-烟碱含量非常低，一般低于烟碱总含量的0.1％甚至更低。因此，烟碱异构体组成分析对研究烟草生物碱的代谢、积累等方面具有重要意义。

文献调研表明：分离检测烟碱异构体组成的主要方法为液相色谱法，同时也有利用核磁共振与二维气相色谱法。液相色谱法的反相色谱普遍存在色谱柱类型不常见(C1微柱、α-酸糖蛋白柱)，流动相添加剂复杂(甲醇：水流动相梯度洗脱，添加剂为磷酸氢二钾与正癸酸)，重复性不好及分离度不够(基本基线分离1≤Rs≤1.5)等缺陷，正相色谱的使用又需要将液相色谱在正相与常用的反相系统之间进行转换(正相液相色谱Chiralcel OD-H手性柱)，使得分析较为复杂。核磁共振与二维气相色谱(二维气相色谱-火焰离子化检测器或氮磷检测器)都需要特殊的仪器，难以进行实验室的常规分析。

专利文献调研表明：对烟碱异构体组成检测主要采用正相液相色谱-紫外检测器或串联质谱检测器，串联手性柱-超高效合相色谱-紫外检测器或串联质谱检测器与气相色谱-串联质谱检测器。正相色谱也需要将液相色谱在正相与常用的反相系统之间进行转换，紫外检测器对R-烟碱的检测限仅为0.08％，尽管串联质谱能提高方法的检测灵敏度，对R-烟碱的检测限达到0.01％水平，但串联质谱仪器对于常规实验室难以实现，且需要氘代同位素作为内标对基质效应进行校正。此外，串联手性柱与超高效合相色谱运行与维护成本较高，难以适应实验室内对样品的大批量检测与分析。

在烟碱异构体的提取与净化方面，文献与专利常采用碱性溶液释放烟碱，有机溶剂振荡或超声提取后直接进样分析，也有采用基质分散固相萃取初步净化后进样，但常存在提取液色素含量较高，易导致手性色谱柱污染等问题，且净化过程中未对烟碱异构体进行富集，导致方法灵敏度不高。综上所述，有必要开发一套简单快速、重复性好、分离度与灵敏度高的新颖前处理技术与色谱检测方法对鲜烟叶中的烟碱异构体组成进行定性与定量分析。

发明内容

针对背景技术中的不足，本发明的目的是提供一种基于衍生化净化与反萃取富集技术分析鲜烟叶中烟碱异构体的方法，该方法采用商业化的常规全多孔多糖衍生物AMP色谱柱，流动相与添加剂组成简单，利用液相色谱与紫外检测器进行分离检测，优化后分离度达到1.60，结合(1S)-(-)-莰烷酰氯衍生化净化与反萃取富集技术，能有效提高方法的重复性(RSD＜2％)与检测限(R-烟碱占比检测限0.01％)。