[发明专利]一种长单链DNA的制备方法

说明书

本发明公开了一种借助I类和II类水解性脱氧核酶高效制备长单链DNA的方法。该方法主要包括设计并构建重组噬菌粒，获得噬菌粒环状单链DNA步骤，同时采用I类脱氧核酶和II类脱氧核酶突变体切割环状单链DNA，纯化回收酶切得到的所述长单链DNA。利用这两类能快速水解DNA的脱氧核酶，可代替限制性内切酶，低成本的实现对辅助噬菌体法制备出的DNA序列的特异性切割，大量、经济、高纯度制备任意长度和序列的单链DNA。

技术领域

本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种利用两类能快速水解DNA的脱氧核酶，结合辅助噬菌体制备长单链DNA的方法。

背景技术

目前，DNA纳米技术，基因编辑如knock in(基因敲入)等生物医学研究领域对单链DNA(Single strand DNA,ssDNA)，尤其对长单链DNA(100个碱基)具有广泛需求。然而，受化学合成方法的限制，长单链DNA的合成难以保证产率、产量和满意的性价比，因此对于长单链DNA需要借助于生物酶的体内或体外作用以及一些辅助变性的手段，目前常用的长单链DNA的制备方法主要有反转录法，酶降解法，变性高效液相色谱(HPLC)法，磁珠生物素(Biotin)修饰法，非对称PCR法，RCA法等。但在实际应用中，这些方法都存在产率低下、成本高昂等问题。

辅助噬菌体法是一种较新的制备单链DNA的方法。其基本原理是构建一个含有M13复制起始点(M13ori)或者f1复制起始点(f1ori)的质粒，转入到含有F'因子的宿主细胞中，再用一个有缺陷的辅助噬菌体去感染。辅助噬菌体可以帮助该质粒形成单链DNA并包裹成噬菌体，分泌出宿主细胞(如图1所示)。该方法成本低、产量高，是一种非常适合长单链DNA序列制备的方法。但其形成的单链DNA为环状，且含有一段必需的M13ori/f1ori保守序列。若采用传统的限制性内切酶酶切的方法获得想要的单链DNA部分，则会极大提高制备成本。同时该方法受限于内切酶对DNA识别序列的依赖性。

而脱氧核酶(Deoxyribozyme)是一种具有催化功能的单链DNA片段，具有高效的催化活性和结构识别能力，可以催化包括DNA的磷酸化、腺苷化、去糖基化等多种化学反应。近年来，也有研究者筛选出了以Zn²⁺作为辅助因子、能够在特定位点水解DNA磷酸二酯键的脱氧核酶，并利用脱氧核酶水解单链DNA。但是现有技术中利用I类脱氧核酶进行切割反应，所得单链DNA 5’端残留AG两个碱基，3’端残留GTTGA五个碱基，并不能实现单链DNA序列完全自定义，不能完全满足探针制备等实际应用中的需求。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明利用两类能快速水解DNA的脱氧核酶代替限制性内切酶，可以低成本的实现对辅助噬菌体法制备出的DNA序列的特异性切割，获得任意长度和序列的单链DNA。

一方面，本发明提供了一种长单链DNA的制备方法，包括同时采用I类脱氧核酶和II类脱氧核酶突变体切割环状单链DNA的步骤。

可选择地，所述I类脱氧核酶为I-R3，其底物域序列如SEQ ID NO：1所示，酶域序列如SEQ ID NO：2所示的序列。

可选择地，所述II类脱氧核酶突变体为II-R1a，II-R1b，II-R1c，II-R1d中的一种。所述II类脱氧核酶突变体为II-R1a的底物域序列如SEQ ID NO：3所示，酶域序列如SEQ IDNO：4所示的序列；所述II类脱氧核酶突变体为II-R1b的底物域序列如SEQ ID NO：5所示，酶域序列如SEQ ID NO：6所示的序列；所述II类脱氧核酶突变体为II-R1c的底物域序列如SEQID NO：7所示，酶域序列如SEQ ID NO：8所示的序列；所述II类脱氧核酶突变体为II-R1d的底物域序列如SEQ ID NO：9所示，酶域序列如SEQ ID NO：10所示的序列。所述II类脱氧核酶突变体的茎干区域序为任意核苷酸序列。

可选地，在所述切割环状单链DNA的步骤中，在收集的环状单链DNA中，加入脱氧核酶切割反应缓冲液1(50mM HEPES，100mM LiCl，pH 7.0)。