[发明专利]一种在线检测植物样品中褪黑素的方法

说明书

本发明提供一种检测植物样品中褪黑素的方法，包括：待检测样品的制备；采用全自动在线固相萃取‑液相色谱‑串联质谱技术对待检测样品进行检测；根据检测得到的所述待检测样品中植物褪黑素和所述褪黑素稳定同位素内标的峰面积值，计算植物样品中内源性褪黑素的含量。本发明是基于全自动在线SPE‑LC‑MS/MS技术建立的一种全自动在线检测植物样品中褪黑素的方法，具有快速、准确、通量高、灵敏度高等特点，同时使用的有机溶剂更少，不但降低了成本而且该方法更加绿色和环保。

技术领域

本发明属于生物技术及分析化学领域，具体涉及一种应用全自动在线固相萃取-液相色谱-串联质谱技术(on-line SPE-LC-MS/MS)快速准确检测植物样品中褪黑素含量的方法。

背景技术

褪黑素(Melatonin，MLT)又名N-乙酰基-5-甲氧基色胺，是一种吲哚色胺类激素，最早发现于牛的松果体中，随后发现其在人体、动物、微生物、植物中广泛存在，并发挥着重要的激素调节功能。在动物和人体内，褪黑素能够维持生理节奏活动的昼夜节律，有利于睡眠；同时还具有增加机体免疫功能、抗衰老、抑制肿瘤细胞生长、缓解精神压力的作用。在高等植物体内，褪黑素不但参与调控种子萌发、根系生长、叶片衰老、开花及果实成熟等重要的生长发育过程，而且参与植物对重金属、盐、低温、高温、干旱、病菌等生物和非生物胁迫的响应和调控。由于其广泛而重要的生理功能，褪黑素正逐渐被广泛定义为一种新的激素类化合物，越来越多的农业和植物领域科学家开始关注植物褪黑素的研究。

褪黑素是一种色胺类小分子化合物，在植物体内以低浓度来调节植物的生理活动，其性质不稳定并且容易受到植物基质中其他次生代谢产物的干扰。因此准确定量分析植物体内的褪黑素含量对于阐明其合成代谢途径及重要生理功能具有非常重要的意义。

液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术具有灵敏度高、重现性好等优点，是目前复杂基质中痕量化合物分析检测的有效手段，也是目前检测分析褪黑素方法的主流技术。然而，现有的植物材料内源褪黑素的定量分析方法中，样品前处理的方法均为离线人工多步骤处理。如Rita Paroni等人(Journal of Food Composition and Analysis，2019)检测杏仁和开心果中褪黑素时，采用5、2.5、2.5mL的乙醇分三次进行提取，每次提取时分别涡旋3min，离心5min后，上清液在-80度静置30min，再用滤纸过滤后再进行SPE柱富集纯化。此方法存在操作复杂、，耗费时间长和重复性差等的问题。Melanie Stürtz等人(Food Chemistry，2011)采用10mL的乙腈检测对10-15g草莓样品超声中的提取褪黑素，此方法存在有机溶剂试剂消耗量大和样品材料量大等问题。总之，多步骤离线的样品前处理的方法存在操作繁琐复杂，耗费时间长，净化效率低，消耗大量有机溶剂等问题，而且离线操作人为影响因素较大，容易引入误差和污染。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物样品中内源褪黑素的定量检测方法，所述方法具有快速、准确、高通量和高灵敏度的特点。

本发明所提供的植物样品中内源褪黑素的定量检测方法，包括：

步骤(1)待检测样品的制备；

步骤(2)采用全自动在线固相萃取-液相色谱-串联质谱技术对待检测样品进行检测；

步骤(3)根据检测得到的所述待检测样品中植物褪黑素和所述褪黑素稳定同位素内标的峰面积值，计算植物样品中内源性褪黑素的含量。

步骤(1)待检测样品的制备采用包括以下步骤的方法：对植物样品进行预处理，得到处理后的溶解液，即待检测样品；

所述植物样品包括富含和/或不富含油脂的植物组织材料；