[发明专利]一种在线检测植物样品中褪黑素的方法

权利要求书

1.一种植物样品中内源褪黑素的定量检测方法，包括：

步骤(1)待检测样品的制备；

步骤(1)待检测样品的制备采用包括以下步骤的方法：对植物样品进行预处理，得到处理后的溶解液，即待检测样品；

所述植物样品包括富含和/或不富含油脂的植物组织材料；

所述植物样品为不富含油脂的植物组织材料，所述预处理为处理a：将所述植物组织材料在液氮中研磨成粉末，准确称取样品量，加入提取试剂和褪黑素稳定同位素内标，混匀，进行提取，离心，收集上清液，吹干，用复溶溶剂溶解已吹干的样品，得到处理后的溶解液，即待检测样品；

所述植物样品为富含油脂的植物组织材料，所述预处理为处理b：将所述植物组织材料在液氮中研磨成粉末，准确称取样品量，加入提取试剂和褪黑素稳定同位素内标，混匀，进行提取，离心，收集上清液，吹干，用复溶溶剂溶解已吹干的样品，离心，吸取中间层不含油脂的部分，得到处理后的溶解液，即待检测样品；

步骤(2)采用全自动在线固相萃取-液相色谱-串联质谱技术对待检测样品进行检测；

步骤(3)根据检测得到的所述待检测样品中植物褪黑素和褪黑素稳定同位素内标的峰面积值，计算植物样品中内源褪黑素的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述植物样品为植物的根、茎、叶、花、花粉、果实或种子；

所述植物为拟南芥、水稻、油菜、玉米、番茄、烟叶或豆类；

所述提取试剂为乙酸乙酯或甲醇、或甲醇与水的混合液；

所述褪黑素稳定同位素内标通过以下任意一种方法制备得到：

1)将植物褪黑素中部分或全部的碳原子替换为¹²C的同位素；

2)将植物褪黑素中部分或全部的氮原子替换为¹⁴N的同位素；

3)将植物褪黑素中部分或全部的氢原子替换为¹H的同位素；

4)将植物褪黑素中部分或全部的氧原子替换为¹⁶O的同位素；

所述植物组织材料的用量为10-500mg，其与提取试剂的用量比例为100mg：(0.5-5)mL；

所述褪黑素稳定同位素内标的加入量计为S0，其与所述植物组织材料的配比为：50-500pg：100mg；

所述提取步骤中，提取在低温条件下进行超声，超声时间为30-120min；

所述离心的条件为：在4℃下15000rpm的转速离心15min；

所述复溶溶剂为不同比例的甲醇和水的混合溶剂；

所述复溶溶剂与植物组织材料的配比为(50-300)μL:100mg。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(2)采用全自动在线SPE-LC-MS/MS系统通过全自动在线固相萃取-液相色谱-串联质谱技术对待检测样品进行检测，

其中，所述在线SPE-LC-MS/MS系统为：Symbiosis^TMPharma在线固相萃取-液相色谱系统串联Qtrap 5500三重四级杆线性离子阱混合模式质谱系统。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述在线SPE-LC-MS/MS系统中在线固相萃取的条件如下：

采用反相材料的SPE小柱；

所述在线SPE的处理过程包括：活化、平衡、上样、淋洗、洗脱、再生小柱；

其中，活化所用溶剂为甲醇，其流速为2000μL/min，体积为1000μL；

平衡所用溶剂为水，其流速为2000μL/min，体积为1000μL；

上样所用溶剂为水，其流速为250μL/min，体积为40μL；

淋洗所用溶剂为5％甲醇，其流速为2000μL/min，体积为1000μL；

洗脱所用溶剂为70％甲醇，其流速为100μL/min，体积为150μL；

再生所用溶剂为70％甲醇，其流速为2000μL/min，体积为500μL；

进一步再生所用溶剂为70％甲醇，其流速为2000μL/min，体积为500μL。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述SPE小柱为C18填料的小柱。