[发明专利]一种樟叶越桔悬浮细胞培养体系的建立方法

说明书

本发明公开一种樟叶越桔悬浮细胞培养体系的建立方法，属于植物细胞工程领域。本发明所述方法，本发明所述方法以樟叶越桔组培苗的幼嫩叶为外植体，将处理好的幼嫩叶放入诱导培养基中诱导出愈伤组织，将愈伤组织转移到增殖培养基中，生长成适合悬浮培养的状态，将适宜的愈伤组织转移到液体培养基中，成为稳定的悬浮培养体系。本发明所述方法可以根据实际生产选择相应的培养组合进行生产，从而降低生产成本，提高效率，为工厂化生产樟叶越桔悬浮培养体系提供指导依据。

技术领域

本发明涉及一种樟叶越桔悬浮细胞培养体系的建立方法，属于植物细胞工程领域。

背景技术

樟叶越桔(Vaccinium dunalianum)为杜鹃花科(Ericaceae)越桔属(Vaccinium)常绿灌木，主要分布于云南西北部经滇中高原至滇南和滇东。其果实营养丰富，全株具有舒筋活络、祛风除湿等功效，具有较高的药用和保健价值。此外，樟叶越桔也是一种富含咖啡酰熊果苷类物质的特殊资源植物，其主要成分的黑色素生成抑制活性优于熊果苷，且毒性仅为熊果苷的1/2，可作为熊果苷天然替代资源加以开发利用。樟叶越桔目前仍处于野生状态，由于连年遭受破坏性采摘，导致其野生资源急剧减少，因此利用生物技术手段建立其培养体系具有重要意义。

植物细胞培养包括通过植物幼胚、原生质体、细胞、组织、器官的培养，生产重要的次生代谢产物、新的植物个体(种苗的快速繁殖)，以及进行植物细胞生理生化和遗传学研究的一个工程学和生物学相结合的交叉学科。近年来植物细胞培养以其独特的优势，越来越收到科学家的青睐，首先，细胞培养过程可以在培养皿中连续、均匀的进行，不会受到气候、病虫害等外界因素的影响；其次，培养过程可以在生物反应器中大规模进行，可以人为的对反应条件进行控制，提高目标产物的得率。近年来，国内学者利用细胞悬浮培养技术在人参(Panax ginseng)、西洋参(P.quinquefolius)、三七(P.notoginseng)、紫草(Lithospermum erythrorhizon)、红豆杉(Taxus chinensis)、雪莲(Saussureainvolucrata)和银杏(Ginkgo biloba)等药用植物次生代谢产物的生产调控上开展了许多研究，但细胞悬浮培养技术在樟叶越桔植物上的应用尚未见报道。本发明以樟叶越桔组培苗幼嫩叶为材料研究了愈伤组织的诱导及增殖条件，建立了樟叶越桔的细胞悬浮培养体系，以期进一步为樟叶越桔中咖啡酰熊果苷类物质的生产调控奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种樟叶越桔悬浮细胞培养体系的建立方法，使用樟叶越桔组培苗的幼嫩叶诱导愈伤组织并建立细胞悬浮培养体系，该方法生产成本低，效率高，为工厂化生产樟叶越桔悬浮培养体系提供指导依据。

进一步的，本发明所述樟叶越桔悬浮细胞培养体系的建立方法，具体包括以下步骤：

(1)愈伤组织的诱导：切取樟叶越桔组培苗的幼嫩叶片，将叶片的正面或者背面划上条形伤口，将叶片的背面紧贴诱导培养基生长，诱导出愈伤组织；

所述诱导培养基为WPM基本培养基与细胞生长素的组合：WPM+1.0～2.0 mg/L 6-BA+0.05～1.0mg/L NAA+1.0～2.0mg/L 2,4-D+28～42g/L蔗糖+4.5～5.3g/L 琼脂。

本发明培养基中1.0～2.0mg/L 6-BA指1L的WPM基本培养基中加入 1.0～2.0mg的6-BA，28～42g/L蔗糖是指1L的WPM基本培养基中加入30g蔗糖，本发明中其他添加剂的表述的含义同上。

(2)愈伤组织的增殖：挑选挑选无褐化、生长旺盛的愈伤组织，转移至 WPM增殖培养基中培养，生长成适合悬浮培养的状态；

所述WPM增殖培养基为WPM基本培养基与细胞生长素的组合： WPM+1.0～2.0mg/LZT+0.2～0.6mg/L NAA+28～42g/L蔗糖+4.5～5.3g/L琼脂。