[发明专利]一种樟叶越桔悬浮细胞培养体系的建立方法

权利要求书

1.一种樟叶越桔悬浮细胞培养体系的建立方法，其特征在于：使用樟叶越桔组培苗的幼嫩叶诱导愈伤组织并建立细胞悬浮培养体系；

具体包括以下步骤：

（1）愈伤组织的诱导：切取樟叶越桔组培苗的幼嫩叶片，将叶片的正面或者背面划上条形伤口，将叶片的背面紧贴诱导培养基生长，诱导出愈伤组织；所述诱导培养基为WPM基本培养基与细胞生长素的组合：WPM+1.0～2.0mg/L6-BA+0.05～1.0mg/LNAA+1.0～2.0mg/L2,4-D+28～42g/L蔗糖+4.5～5.3g/L琼脂；

（2）愈伤组织的增殖：挑选无褐化、生长旺盛的愈伤组织，转移至WPM增殖培养基中培养，生长成适合悬浮培养的状态；所述WPM增殖培养基为WPM基本培养基与细胞生长素的组合：WPM+1.0～2.0mg/LZT+0.2～0.6mg/LNAA+28～42g/L蔗糖+4.5～5.3g/L琼脂；

（3）悬浮体系的建立：挑选生长旺盛的半透明愈伤组织转移至液体培养基中，培养7～10d后去掉大颗粒的愈伤组织；筛选后的小颗粒愈伤组织用无菌水充分清洗后，转移至新鲜的液体培养基中培养，形成稳定的悬浮培养体系，分离得到悬浮培养细胞Ⅰ；

所述液体培养基为WPM培养基与细胞生长素的组合：WPM培养基+1.5～2.5mg/LZT+0.3～0.6mg/LNAA+28～42g/L蔗糖；

所述培养7～10d后去掉大颗粒的愈伤组织的大小颗粒筛选过程为：用40～60目不锈钢筛过滤，筛下组织即为小颗粒愈伤组织；

步骤(1)中培养条件为：25±2℃，光照强度30-50μmol/m²·s ，光照周期10～12h/d，培养时间为50～60d；

步骤(2)中愈伤组织的增殖的条件为：25±2℃，暗培养，培养时长70～90d；

步骤(3)中培养条件为：25±2℃，暗培养，培养基pH值为4.8～5.2，摇床转速为120～160rpm/min，小颗粒愈伤组织培养时长7～10d。

2.根据权利要求1所述樟叶越桔悬浮细胞培养体系的建立方法，其特征在于：步骤(3)中WPM培养基替换为改良WPM培养基；

所述改良WPM培养基，是指相较于正常的WPM培养基，有机四样的含量只有普通的3/5，即3/5有机四样含量为：盐酸硫胺素1mg/L、盐酸吡哆锌0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、甘氨酸2mg/L。