[发明专利]犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了犬瘟热病毒CDV‑3株感染性cDNA克隆及其构建方法和应用。本发明以犬瘟热病毒CDV‑3株为模板，将CDV‑3的全长分5个片段进行RT‑PCR扩增。经酶切拼接，将5个片段顺次插入到真核载体，同时在F1首端和F5末端分别加入锤头状核酶和丁型肝炎核酶序列，获得犬瘟热病毒CDV‑3株感染性cDNA克隆。然后，构建表达CDV‑3N、P、L蛋白的三个辅助质粒。将犬瘟热病毒CDV‑3株感染性cDNA克隆和三个辅助质粒共转染293T细胞，获得拯救后的重组CDV‑3病毒(rCDV‑3)。研究发现，获得的rCDV‑3病毒滴度最高达到10^7.667TCID₅₀/mL，比wtCDV‑3高出10倍。rCDV‑3感染Vero细胞后，于感染后36h迅速达到最高病毒滴度，而wtCDV‑3于感染后72h时病毒含量达到最高。本发明的提出为犬瘟热病毒新型疫苗研制、致病机理研究奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种感染性cDNA克隆及其构建方法和应用，特别涉及一种犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆及其构建方法和应用，本发明属于生物技术领域。

背景技术

犬瘟热(Canie Distemper，CD)是由犬瘟热病毒(Canie Distemper Virus，CDV)感染犬、水貂等多种肉食动物而引起的一种高度接触性传染病。该病传染性高，发病率高，临床症状多样，感染后期容易形成继发和混合感染。近年来，犬瘟热病毒自然感染宿主不断扩大。据报道，野生动物老虎、狮子、豹和海豹，甚至大熊猫群体中都暴发过犬瘟热。2015年1月，我国陕西省珍稀野生动物抢救饲养研究中心圈养的5只大熊猫因感染CDV强毒而死亡，冯娜等在实验室对组织病料进行了CDV分离鉴定，及其全基因组序列测定与进化分析，证实：此毒株属于Aisa I型强毒株，命名为giant panda/SX/2014(FENG NA,YU YICONG,TIECHENG.W,et al.Fatal canine distemper virus infection of giant pandas inChina.[J].Scientific Report,2016,6:27518-7.)。实际上，我国和日本学者都曾报道：CDV能够自然感染非人灵长类动物，如我国猕猴和日本食蟹猴。而且，在人变形性骨炎Paget’s患者体内检测到CDV核酸。可见，犬瘟热病毒正在给全球动物养殖业和生物多样化带来极大的损失和危害。因此，预防和消除犬瘟热迫在眉睫。

目前世界范围内，犬瘟热的预防一直依靠弱毒活疫苗。但，犬瘟热病毒的感染和传播依然不容乐观。近几年数据显示，虽然许多动物接种弱毒活疫苗，但仍然存在免疫后犬瘟热发病的案例(RENATA DA FONTOURA BUDASZEWSKI,LUCIANE DUBINA PINTO,MATHEUSNUNES WEBER,et al.Genotyping of canine distemper virus strains circulating inBrazil from 2008 to 2012.[J].Virus Research,2014,180:76-83.MARTELLA V,ELIA G,BUONAVOGLIA C.Canine distemper virus.[J].Vet Clin North Am Small Anim Pract,2008,38(4):787-97)。

犬瘟热病毒属于副粘病毒科麻疹病毒属成员，是单股负链、不分节段RNA病毒。CDV基因组大小为15690bp，从3’到5’端依次是3’端前导序列、核蛋白基因(N)、磷蛋白基因(P)、基质蛋白基因(M)、融合蛋白基因(F)、血凝素蛋白基因(H)和大转录蛋白基因(L)和5’端尾随序列。