[发明专利]犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）取冻存的犬瘟热病毒CDV-3株细胞培养悬液，提取总RNA，反转录合成cDNA；

（2）将CDV-3的全长cDNA分成5个片段进行RT-PCR扩增，扩增产物依次命名为：F1、F2、F3、F4和F5，其中，用于扩增F1片段的引物为QF1-F以及QF1-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.2所示，用于扩增F2片段的引物为QF2-F以及QF2-R，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3以及SEQ ID NO.4所示，用于扩增F3片段的引物为QF3-F以及QF3-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5以及SEQ ID NO.6所示，用于扩增F4片段的引物为QF4-F以及QF4-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7以及SEQ ID NO.8所示，用于扩增F5片段的引物为QF5-F以及QF5-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9以及SEQ ID NO.10所示；

（3）经酶切拼接，将5个片段顺次插入到真核载体中，获得克隆有CDV-3株全长cDNA的质粒，即犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆; 所述的CDV-3株全长cDNA的核苷酸序列如SEQID NO.13所示；

其中，步骤（3）中所述的真核载体为改造后的真核载体pcDNA3.1，pcDNA3.1通过以下步骤进行改造：用内切酶PmeI酶切pcDNA3.1，回收大片段后，与事先制备的双链DNA连接，其中所述的双链DNA的上链如SEQ ID NO.11所示，所述的双链DNA的下链如SEQ ID NO.12所示，得到改造后真核载体pcDNA3.1，改造后的真核载体pcDNA3.1中多克隆位点变为NheI-NotI-BsiwI-Bsp1407I-CpoI-部分丁型肝炎核酶序列，改造后的pcDNA3.1称为pcDNA3.2。

2.按照权利要求1所述的方法构建得到的犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆。

3.权利要求2所述的犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆在制备犬瘟热病毒rCDV-3株中的应用。

4.一种犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆的病毒拯救方法，其特征在于，包括以下步骤：构建表达犬瘟热病毒CDV-3株N、P、L蛋白的三个辅助质粒，利用转染试剂Lipofectamine^TM 2000将按照权利要求1或2所述的方法构建得到的犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆和三个辅助质粒共转染293T细胞，3 d后，上清接种到Vero细胞，观察犬瘟热病毒典型合胞体病变，出现犬瘟热病毒典型的合胞体样细胞病变时，反复冻融收获病毒液，对重组病毒进行免疫荧光鉴定和标签鉴定，得到拯救后具有感染性的犬瘟热病毒rCDV-3株；所述的三个辅助质粒通过以下方法制备：针对CDV-3株N、P和L基因的开放阅读框区域，以合成的CDV-3株的全长cDNA为模板，进行PCR扩增，获得扩增产物N、P和L，回收纯化片段N、P和L，分别连接至pcDNA3.1，得到pcDNA3.1-N，pcDNA3.1-P和pcDNA3.1-L三个辅助质粒，每个质粒用量为：犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆5 µg，辅助质粒pcDNA3.1-N 1 µg，pcDNA3.1-P 0.8 µg和pcDNA3.1-L 0.5 µg。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，用于扩增N基因的开放阅读框区域的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.14以及SEQ ID NO.15所示，用于扩增P基因的开放阅读框区域的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.16以及SEQ ID NO.17所示，用于扩增L基因的开放阅读框区域的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.18以及SEQ ID NO.19所示。

6.按照权利要求4所述的方法拯救获得的重组犬瘟热病毒rCDV-3株。