[发明专利]一种乙脑病毒SA14-14-2的克隆方法及应用

说明书

本发明提供了一种乙脑病毒SA14‑14‑2的克隆方法：根据NCBI公布的D90195.1基因序列为参照分别合成6段基因序列，利用同源重组技术通过相应酶切位点将合成序列依次克隆至线性化载体中，获得乙脑病毒SA14‑14‑2的全长克隆。本发明采用同源重组技术，可简单、快速并且高效的将插入片段定向克隆至载体任意位点。仅需将插入片段正/反向引物5’端引入线性化载体的末端序列，使之包含载体的同源臂，后按一定比例混合，在重组酶催化下，37℃反应30min即可完成，极大的节约了连接时间。同时由于独特的非连接酶依赖体系，极大降低了载体自连背景，同时对杂质的耐受度增加，提高了其阳性率并简化了实验步骤。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种乙脑病毒SA14-14-2的克隆方法及应用。

背景技术

我国的乙脑病毒减毒活疫苗株SA14-14-2株是将强毒株SA14通过地鼠肾单层细胞长期传代获得的稳定弱毒株,具有良好的免疫性,免疫机制除体液免疫外还具有明显的细胞免疫,显然优于灭活疫苗

目前在我国累积接种人数超过1亿人,其安全性和预防效果已得到充分证实。本研究在对SA14-14-2株进行全序列测定基础上,探索以减毒活疫苗株为母本，体外构建其全长基因组的cDNA克隆,转录成RNA后转染细胞，使其在细胞内进行包装，得到可以表达相应蛋白的重组病毒，进行感染性克隆的构建，为进一步研究疫苗减毒机理、开发新型疫苗及新型疫苗载体莫定基础。

在传统的分子克隆技术中,一般利用“酶切-连接”的方式将目的DNA与载体进行连接:首先通过限制性酶切在目的DNA和载体DNA上制造互补的黏性末端或者平末端,再用连接酶将二者连在一起,生成带有目的DNA的载体,也称为重组载体。限制性内切酶特异性地识别靶DNA序列(即酶切位点)。因此,为了能够对多个目的DNA片段进行操作,常用的工程化及商业化的载体通常具有多克隆位点,且针对目的DNA片段的操作(例如插入、替换和/或删除)大多在多克隆位点处进行。在实践中,对目的DNA的每次操作都需要进行一系列的酶切连接、转化和筛选步骤,该过程需要数天时间。此外,常常发生需要操作的位置没有酶切位点、或希望使用的限制性内切酶在载体或目的片段上存在多个靶点的情况,此时需要更多的时间和更繁琐的步骤对载体进行改造。当需要将多个片段连入载体时,传统的分子克隆技术费时耗力且成本极高。

另外，乙型脑炎病毒属于非逆转录RNA病毒，由于病毒复制过程中不形成DNA中间体，及RNA的不稳定性及难操作性，使得我们无法直接对其基因组进行操作。因此将病毒RNA逆转录成cDNA并进行克隆，使其以DNA稳定状态存在，以便对其基因组进行突变、替换等操作后通过体外转录为相应的病毒RNA，转染细胞后获得新病毒，为病毒结构的研究带来方便，并为新型疫苗的研究开辟新的途径。

发明内容

本发明利用同源重组克隆技术将乙脑病毒减毒株SA14-14-2的基因组分段克隆到载体pcr2.1上，获得了乙脑病毒减毒株SA14-14-2的全长克隆。

本发明采用以下技术方案：

一种乙脑病毒SA14-14-2的克隆方法，具体方法为：根据NCBI公布的D90195.1基因序列为参照分别合成6段基因序列，利用同源重组技术通过相应酶切位点将合成序列依次克隆至线性化载体中，获得乙脑病毒SA14-14-2的全长克隆。

优选地，所述线性化载体为pcr2.1载体。

优选地，所述乙脑病毒SA14-14-2的全长cDNA序列如序列表1所示。

优选地，所述合成6段基因序列分别如序列表2-序列表7所示。

本发明还提供了一种采用同源重组技术制备的乙脑病毒减毒株SA14-14-2的全长克隆在新型乙脑重组嵌合疫苗的制备中的用途。