[发明专利]使用血小板和中性粒细胞诱导和监测NETs形成的体外方法

说明书

本发明提供了使用血小板和中性粒细胞诱导和监测NETs形成的体外方法，包括分离血小板和中性粒细胞、调整血小板悬液和中性粒细胞悬液浓度、激活血小板、将预激活血小板悬液和中性粒细胞悬液混合、培养混合细胞悬液构建荧光强度‑时间动力学曲线。本发明的方法操作简单易行，熟练操作人员可在2h内完成标本制备，5h内完成标本检测，不需要特殊昂贵的试剂或仪器，稳定可重复。

技术领域

本申请属于免疫学和血液、细胞生物学领域，具体地，本申请提供了一种使用血小板和中性粒细胞诱导和监测NETs（Neutrophil extracellular traps，NETs）形成的体外方法。

背景技术

中性粒细胞是粒细胞的一种，占血液循环白细胞的50%至70%，其细胞核呈杆状或分叶状，胞质内有大量可被中性染料染色的细小颗粒。它是数量最多的固有免疫细胞，通过吞噬、氧爆发和脱颗粒等方式对进入体内的病原体起到杀伤和限制作用。

NETs形成是中性粒细胞发挥免疫效应的特殊形式。中性粒细胞在豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯（Phorbol myristate acetate ，PMA）、金黄色葡萄球菌、脂多糖或激活的血小板等诱导物的作用下可发生激活，经一系列反应产生NETs。NETs本质上是修饰有颗粒蛋白的解聚染色体，主要成分包括DNA、组蛋白、髓过氧化物酶和弹性蛋白酶等。依靠特殊的网状结构和各种效应蛋白，NETs对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、病毒等病原体都有很好的捕获和杀伤效应，在限制病原体扩散方面发挥了重要的生理作用。但近年来，大量研究发现脓毒症、缺血再灌注、动脉粥样硬化、深静脉血栓和系统性红斑狼疮等病理状态都伴随 NETs形成过度，且有动物实验证实使用药物干预或基因敲除等手段消除NETs或抑制NETs形成能明显减轻靶器官的病理损伤，提示NETs是多种疾病引起器官功能损伤的重要介质，可以作为减轻器官功能损伤极有潜力的治疗靶点。

目前为止，虽然在体外研究中已经有数十种物质或病原体被证明能诱导NETs形成，但大部分都没有模拟体内NETs形成的微环境。例如专利CN108362871A就是采用PMA刺激中性粒细胞的形式诱导NETs形成。PMA诱导NETs形成以及与之相似的诱导方法虽然能够部分揭示NETs形成的机制，但不足以反映体内NETs形成的全过程。并且PMA诱导NETs形成都伴随细胞裂解，而目前又无研究证实体内存在这种经细胞裂解的NETs形成。所以，建立一种模拟体内NETs形成的稳定技术体系，对于NETs形成的检测、诊断和药物筛选具有重要意义。

血小板是巨核细胞产生的无核盘状细胞，是凝血系统的重要组成成分。血小板表面表达有蛋白酶激活受体、Toll样受体等受体，可识别凝血或病原刺激物而发生激活，出现聚集、形态改变、效应物质分泌和表面特异分子上调等变化。目前，既有体外研究发现激活的血小板与中性粒细胞共培养能够诱导NETs形成，又有体内研究发现去除血小板、抑制血小板激活或阻断血小板与中性粒细胞的相互作用能够抑制体内NETs形成，提示血小板激活与病理条件下体内NETs过度形成有重要联系。

目前尚无使用新鲜血小板和中性粒细胞诱导NETs形成的固定方法。各研究单位所用的血小板和中性粒细胞制备方法及NETs诱导、检测方法都不相同，普遍存在耗时长、成本高等问题。因此，用新鲜血小板和中性粒细胞来建立稳定可重复的NETs形成体外模型，更能模拟体内NETs形成的过程，对于NETs形成情况的监测以及随后的药物筛选和治疗方法开发都有重要意义。

发明内容

申请人经过大量实验，建立了使用血小板和中性粒细胞诱导和监测NETs形成的体外方法，其中使用特定范围的比例混合预激活血小板悬液和中性粒细胞，随后进行共培养并通过监测荧光强度构建荧光强度-时间动力学曲线，建立了简单、可重复的使用血小板和中性粒细胞诱导和监测NETs形成的体外方法。