[发明专利]帕利亚姆血清群病毒的实时荧光定量RT-PCR检测引物、探针及检测试剂盒

说明书

本发明涉及帕利亚姆血清群病毒的实时荧光定量RT‑PCR检测引物、探针及检测试剂盒，属于动物病毒分子生物检测技术领域。该试剂盒包括上游引物、下游引物、与引物配合使用的探针、阴性对照模板、阳性对照模板、标准品模板和PCR扩增试剂。采用试剂盒进行检测，反应速度快，整个扩增过程不到1个小时；且只需要提取病毒RNA，无需进行反转录，操作步骤少且简便，能够有效地避免RNA降解和污染；同时，在qRT‑PCR扩增完成后，无需琼脂糖凝胶电泳即可直接判断待检样品是否有PALV RNA的存在；并且配合利用标准品模板建立的标准曲线能够对临床样本内PALV RNA进行定量检测，大大提高工作效率，降低了检测成本。

技术领域

本发明属于动物病毒分子生物学检测技术领域，具体涉及应用TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术对中国流行的帕利亚姆血清群病毒进行快速检测的扩增引物、TaqMan探针及组装的检测试剂盒。

背景技术

帕利亚姆血清群病毒(Palyamserogroup virus,PALV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)成员，广泛流行于北纬49°至南纬35°之间的热带以及亚热带地区。PALV主要通过雌性吸血昆虫库蠓(Culicoides)对动物的吸血性叮咬传播，感染牛羊等反刍动物，导致妊娠动物的生产异常，主要表现为流产、早产、死产或产无脑畸形胎。1985年至1986年，帕利亚姆病毒疫情在曾在日本爆发，其临床症状为新生牛先天性异常，并伴有水脑畸形和小脑发育不良综合征，给畜牧业生产带来了巨大的经济损失。

PALV基因组由10个双链RNA节段(Seg1～Seg10)构成，共编码7个结构蛋白(VP1～VP7)和4个非结构蛋白(NS1～NS3和NS3A)。PALV具有双层衣壳结构，外层衣壳由Seg-2和Seg-6编码的VP2和VP5构成，主要参与介导宿主细胞表面吸附以及细胞膜通透等生物学过程。Seg-2和Seg-5都具有高度的遗传变异性，其中，由Seg-2编码的VP2是诱导被感染动物产生中和抗体的主要抗原，对PALV血清型具有决定性作用。而Seg-3和Seg-7编码的VP3和VP7则构成内层衣壳，VP3组成内层衣壳的骨架，VP7除了参与内层衣壳的构成外，还可能介导病毒粒子对昆虫宿主细胞的感染。Seg-3和Seg-7序列保守程度较高，其中VP7是PALV血清群特异性抗原。PALV具有多种不同的血清型，由于历史原因，不同血清型的PALV往往以病毒首次分离地的地名进行命名，在亚洲存在Chuzan Virus(CHUV)、D’Aguilar Virus(DAV)和Bunyip Creek virus(BCV)三种血清型PALV的流行。

CHUV于2012年首次分离于我国云南省的哨兵牛，在随后开展的云南省、广东省和广西壮族自治区PALV监测与病毒分离工作中，除分离获得多株CHUV外，还在我国首次分离获得BCV和DAV，表明多种血清型的PALV流行于我国南方地区。我国内蒙古、新疆、山东、江苏、湖北、广西和云南等省区牛羊体内CHUV抗体的血清阳性率介于6％～48.65％之间，而海南省牛羊的血清阳性率高达57.35％；另外，甘肃省牦牛CHUV抗体的血清阳性率为7.89％。由此可见，PALV已在我国呈现广泛分布的趋势。为了掌握PALV在我国的流行及分布情况，并制定科学的防控策略，非常有必要建立PALV的快速检测方法。

已有Imadeldin等和杨振兴等分别开发了巢式RT-PCR和竞争性ELISA(competitive ELISA,C-ELISA)方法用于PALV的检测，但是上述两种检测方法都存在不足之处。

(1)巢式RT-PCR的不足之处：需要以第一次扩增产物作为第二次扩增的模板，容易引入污染进而导致假阳性；需要利用琼脂糖凝胶电泳进行检测，耗时较长。

(2)C-ELISA的不足之处：主要对动物血液内的抗体进行检测，而从动物感染PALV到抗体产生，一般需要2～3周，因此，C-ELISA方法在抗体产生之前不能进行早期临床诊断。