[发明专利]一种区别CHUV、BCV与DAV的一步法三重RT-PCR检测引物及试剂盒

说明书

本发明涉及一种区别CHUV、BCV与DAV的一步法三重RT‑PCR检测引物及试剂盒，属于兽医传染病检测技术领域。该试剂盒包括3对引物，分别为CHUV‑P1和CHUV‑P2、BCV‑P1和BCV‑P2、DAV‑P1和DAV‑P2；还包括空白对照模板、阳性对照模板和PCR扩增试剂；空白对照模板为RNase Free Water；所述的阳性对照模板有三个，分别为CHUV、BCV、DAV灭活病毒。采用本发明试剂盒，通过一次RT‑PCR反应就能同时检测CHUV、BCV和DAV等3种PALV血清型病毒，避免了常规PCR的重复检测，具有低成本、高效率等优点，易于推广应用。

技术领域

本发明属于兽医传染病检测技术领域，具体涉及一种区别3种PALV血清型病毒CHUV、BCV与DAV的一步法三重RT-PCR检测引物及试剂盒。

背景技术

帕利亚姆血清群病毒(Palyam serogroup virus,PALV)属呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)成员，主要通过吸血昆虫库蠓(Culicoides spp.)对牛羊等反刍动物的叮咬传播。其中，牛对该病最为易感，感染妊娠母牛出现流产、早产和死产，引起新生犊牛的积水性无脑小脑发育不全综合症(Hydranencephaly cerebellarhypoplasia syndrome,HCH)，给牛羊养殖业带来严重的经济损失。

PALV基因组由10个节段的双链RNA组成(Seg-1～Seg-10)，编码7种结构蛋白(VP1～VP7)和4种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3与NS3a)。其中，Seg-2编码的VP2蛋白构成病毒粒子的最外层衣壳，VP2蛋白介导病毒对细胞表面受体的特异性吸附，参与病毒粒子从感染细胞中的释放，诱导PALV特异性中和抗体的产生，决定病毒的血清型；Seg-2/VP2序列在不同血清型PALV毒株之间高度变异，是鉴别PALV血清型的重要靶基因。

PALV有多种不同的血清型，根据血清中和实验，目前分离出的PALV可分为6种血清群：Chuzan Virus(CHUV)、D’Aguilar Virus(DAV)、Bunyip Creek virus(BCV)、CSIROVillage virus、Marrakai Virus与Petevo virus。我国存在CHUV、BCV与DAV三种PALV血清毒株的流行，分布范围遍及由南(海南)至北(内蒙)，由东(江苏)至西(新疆)的广泛区域，给我国牛羊养殖业的健康发展构成了严重的潜在威胁。不同血清型毒株之间缺乏有效的交叉保护作用，因此，建立PALV不同血清型的鉴定方法对预防和控制PALV具有重要的现实意义。

目前有关PALV血清型鉴定技术，仅有传统的血清中和实验(Serumneutralization test，SNT)，虽然SNT为病毒血清型鉴定的金标准，但是在实际使用中存在一定的不足：(1)SNT耗时长，通常需要1周左右的时间，不利于疫病的快速诊断；(2)SNT需要使用活病毒，存在病毒扩散的生物安全隐患；(3)制备SNT使用的标准阳性血清，需要使用标准毒多次免疫易感动物制备，费时费力；(4)对于多种血清型毒株混合感染的样品，通过SNT进行血清型鉴定时，不同血清型毒株之间可能存在交叉反应，同时还可能漏检某些血清型；(5)SNT需要准备96孔细胞培养板、细胞培养基、胎牛血清等基础材料，增加了实验成本。

病毒核酸检测是鉴定病毒血清型的常用方法。尤其是多重PCR技术，通过在同一反应管内同时加入针对不同血清型毒株的特异性引物，即可实现对多种血清型毒株混合感染样品的准确检测，具有省时省力、简单快速、敏感、特异的优点。然而目前国内尚未建立CHUV、BCV与DAV的多重PCR检测方法，严重阻碍了我国PALV流行病学与病原学的研究；因此，根据我国流行的CHUV、BCV与DAV毒株的序列信息，亟需建立相应的血清型多重PCR检测方法。

发明内容