[发明专利]一种MERS RNA核酸参考品的制备方法

说明书

本发明公开了一种MERS RNA核酸参考品的制备方法，所述制备方法分别将MERS的upE基因和ORF1a基因串联以及ORF1b和N基因串联整合到慢病毒的表达质粒载体中，将构建的两个表达质粒与三个包装质粒分别在工程大肠杆菌菌株中扩增，得到大量的质粒后，再将构建的两个表达质粒分别和三个包装质粒共同转染至HEK293T细胞中，经细胞表达后得到大量的包装了MERS RNA的慢病毒颗粒，本发明涉及基因工程技术领域。该MERS RNA核酸参考品的制备方法，制备的颗粒作为MERS RNA检测的阳性参考品，能很好地模拟从实际样本中提取病毒核酸RNA到核酸检测的整个过程，此外，将该病毒颗粒通过冻干保护剂进行冻干后得到的冻干粉，非常稳定，在45℃放置四周拷贝数基本不变。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种慢病毒颗粒包装中东呼吸 综合征病毒(MERS)的upE、ORF1a以及ORF1b和N基因的RNA片段， 作为MERS RNA检测的阳性参考品的制备方法，并涉及使该阳性参考品的稳 定保存的方法。

背景技术

中东呼吸综合征病毒(MERS)自2012年在沙特被发现，而后在我国及 周边国家时有发生，其致死率高于SARS，能通过空气传播，因而是我国国门 生物安全保障监控的重要烈性病原，监控过程中采用的方法主要是RT-PCR， 而相应的试剂盒一定要匹配阳性质控物质，MERS的核酸检测试剂盒的阳性 参考物质一般为质粒DNA、反转录RNA或灭活的病毒，但这些阳性参考物 质目前都存在着不同的缺陷，如灭活病毒需要三级生物安全实验室，且灭活 病毒的安全性尚不能保证，反转录的RNA性质很不稳定，容易降解，保存困 难，而质粒DNA作为通用的阳性模板不能模拟样本从RNA提取到进行核酸 扩增检测的整个步骤，模拟性不足，这些原因都会导致检测反应的不准确甚 至是假阴性结果，因此，作为试剂盒的阳性参照，如何构建一种可以模拟病 毒从RNA提取至核酸扩增检测步骤全过程的阳性参考物质是一个急需解决的 问题。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种MERS RNA核酸参考品的制备 方法，本发明的MERS核酸阳性参考品能完全模拟病毒RNA提取和核酸检测 全过程，且稳定性高，可用于MERS核酸检测试剂盒的阳性参考，利用本发 明建立的制备方法可以得到高稳定性和高拷贝数的包装了MERS upE和ORF1a RNA以及MERS ORF1b和N基因的慢病毒颗粒。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种MERS RNA 核酸参考品的制备方法，具体步骤如下：

S1、将合成的带有XbaI和BamHI的MERS upE和ORF1a基因，以及 MERS ORF1a和N基因，和慢病毒质粒分别经XbaI和BamHI酶切；

S2、将步骤S1所得的两个MERS基因的核苷酸片段分别连接到慢病毒表 达载体中，构建重组表达质粒；

S3、将两个重组的表达质粒以及慢病毒的三个包装质粒分别转化到大肠 杆菌中，进行扩增并提取相应的质粒；

S4、将步骤S3得到的两个表达质粒分别与3个包装质粒转染至细胞后进 行假病毒颗粒的包装，得到分泌在上清中包装了MERS upE和ORF1a基因以 及包装了MERS ORF1b和N基因RNA的两种假病毒颗粒；

S5、分别收集步骤S4中的细胞培养液上清菌体，过滤，收集两种假病毒 颗粒的粗产物；

S6、将步骤S5得到的两个过滤液分别经PEG8000沉淀，并收集沉淀重 悬至缓冲液PBS中；

S7、将步骤S6得到的溶液经透析袋透析除去PEG8000；

S8、将步骤S7得到的溶液用DNaseI处理，并超离重悬沉淀在PBS中后， 再超离一次，重悬沉淀在PBS中；