[发明专利]一种MERS RNA核酸参考品的制备方法

权利要求书

1.一种MERS RNA核酸参考品的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：

S1、将合成的带有XbaI和BamHI的MERS upE和ORF1a基因，以及MERS ORF1a和N基因，和慢病毒质粒分别经XbaI和BamHI酶切；

S2、将步骤S1所得的两个MERS基因的核苷酸片段分别连接到慢病毒表达载体中，构建重组表达质粒；

S3、将两个重组的表达质粒以及慢病毒的三个包装质粒分别转化到大肠杆菌中，进行扩增并提取相应的质粒；

S4、将步骤S3得到的两个表达质粒分别与3个包装质粒转染至细胞后进行假病毒颗粒的包装，得到分泌在上清中包装了MERS upE和ORF1a基因以及包装了MERS ORF1b和N基因RNA的两种假病毒颗粒；

S5、分别收集步骤S4中的细胞培养液上清菌体，过滤，收集两种假病毒颗粒的粗产物；

S6、将步骤S5得到的两个过滤液分别经PEG8000沉淀，并收集沉淀重悬至缓冲液PBS中；

S7、将步骤S6得到的溶液经透析袋透析除去PEG8000；

S8、将步骤S7得到的溶液用DNaseI处理，并超离重悬沉淀在PBS中后，再超离一次，重悬沉淀在PBS中；

S9、将步骤S8得到的溶液加入冻干保护剂后，冻干得到包装了MERS upE和ORF1a基因RNA以及包装了MERS ORF1b和N基因的两种假病毒颗粒冻干粉。

2.根据权利要求1所述的一种MERS RNA核酸参考品的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中所使用的慢病毒表达质粒载体为pEB-copGFP(T2A)PURO。

3.根据权利要求1所述的一种MERS RNA核酸参考品的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中三个包装质粒分别为VSV-G、PLP1和PLP2。

4.根据权利要求1所述的一种MERS RNA核酸参考品的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中大肠杆菌为DH5α。

5.根据权利要求1所述的一种MERS RNA核酸参考品的制备方法，其特征在于：所述步骤S4中所转染的细胞为HEK293T细胞。

6.根据权利要求1所述的一种MERS RNA核酸参考品的制备方法，其特征在于：所述步骤S4中将慢病毒表达载体质粒连同三个包装质粒转化进HEK293T的具体步骤为：

T1、分别取所需量的无血清细胞培养基、30μL lipofectamine 3000细胞转染试剂盒中的P3000^TM试剂、3～15μg的PLP1、3～15μg的PLP2、3～15μg的VSVG和3～15μg的pEB-copGFP(T2A)PURO-EBOV，再用无血清细胞培养基定容至650μL，轻轻混匀；

T2、另取575μL无血清细胞培养基，稀释75μL lipofectamine 3000试剂，加完后轻轻混匀；

T3、将步骤T1中的650μL混合液加入步骤T2中的650μL混合液，轻轻混匀，室温孵育5min；

T4、用移液器吸净细胞培养盘中的培养基，并用D-Hanks缓冲液1-5mL清洗细胞，将孵育完成的步骤T3中的脂质体溶液均匀的加入至25cm²的细胞培养盘中，在37℃孵育15min；

T5、细胞培养盘中再加入5mL含有10％的胎牛血清的细胞培养液，置于37℃含有5％的二氧化碳的细胞培养箱中培养，6h后更换新鲜的细胞培养液，于24～120h收集上清液两次，并合并两次收集的上清。

7.根据权利要求1所述的一种MERS RNA核酸参考品的制备方法，其特征在于：所述步骤S6中PEG8000沉淀慢病毒颗粒的具体步骤为：在过滤后的细胞培养液上清中加入固体NaCl至浓度为1M，溶解后加入固体PEG8000至终浓度10％，充分振荡溶解，四度冰箱放置过夜，使慢病毒颗粒形成沉淀，在4℃10,000rpm离心15min，弃上清，用500μL PBS缓冲液重悬沉淀，并转移至干净的2mL ep管。