[发明专利]一种重金属暴露对细胞脂质代谢影响的检测方法

权利要求书

1.一种重金属暴露对细胞脂质代谢影响的检测方法，其特征在于，包括步骤：

S1、使用重金属对细胞进行暴露：将PC12细胞接种于细胞培养板中进行培养，接种密度为1.0×10⁵～1.5×10⁵个/ml，每孔培养基体积为2ml，37℃，5％CO₂培养24～36h；待细胞铺满孔板底部面积的75％～85％；遗弃原培养基，重金属暴露组每孔加入含重金属离子浓度6μM～24μM的培养基2ml，对照组加入2ml纯培养基，置于37℃，5％CO₂培养20～26h，每组设置4～8个平行；

其中，所述培养基为：含胎牛血清、青链霉素双抗的DMEM高糖培养基；其中所述DMEM高糖培养基和胎牛血清体积比为9:1，所述培养基中青链霉素双抗的体积分数为1％；

S2、提取脂质代谢产物：分别按下述方法对重金属暴露组与对照组提取脂质代谢产物，步骤如下：移弃含有暴露样品的培养基，每孔加入1～2ml的PBS洗涤并移弃，然后加入2～3ml液氮；液氮挥发后每孔加入1～2ml PBS，混匀后对细胞进行超声破碎，在功率680～720W的冰水浴中超声4～6分钟得破碎悬液，吸取每孔内的破碎悬液分别置于不同的对应离心管，于真空度0.8～1.2Pa，冷阱温度-48～-52，样品温度-18～-22℃冷冻干燥46～50小时，冻干后每个离心管加入10～20μL内标混合液涡旋混匀；再向所述离心管加入甲醇1～2ml，然后加入2～4ml甲基叔丁基醚涡旋震荡提取10～15min，再加入600～900μl水，涡旋1～2min形成两相体系，在4～8℃静置平衡10min～15min，4～8℃、转速为10000～13000g离心10～20min，取上清氮气吹干，最后用200～300μl的复溶液进行复溶，得脂质代谢产物待测试样；其中，所述内标混合液中各物质为：1～2mg/ml磷脂酰胆碱、0.5～1mg/ml磷脂酰乙醇胺、1～2mg/ml甘油三酯、0.5～1mg/ml磷脂酰甘油、0.01～1mg/ml磷脂酰肌醇，溶剂为甲基叔丁基醚；所述复溶液由含有4～8mM乙酸铵的乙腈、异丙醇和水按体积比60～70:20～30:5～10混合而成；

S3、利用基于超高相液相色谱-质谱对脂质代谢产物进行定量分析；脂质代谢产物的定量分析中，非极性组分脂质分离所用的色谱柱为Acquity UPLC BEH C8色谱柱，直径2.1mm、柱长100mm、粒径1.7μm，流动相A为含有10～15mM乙酸铵的乙腈和水按体积比50:50～60:40混匀所得溶液，流动相B为含10～15mM乙酸铵的异丙醇和乙腈按体积比70:30～90:10混匀所得溶液；流动相梯度为：0～1.5min，流动相A体积分数60％～70％，流动相B体积分数30％～40％；

1.5～15.5min流动相B体积分数线性增加到80％～90％，流动相A的体积分数线性降低至20％～10％；15.5～15.6min流动相B的体积分数线性增加到90％～98％，流动相A的体积分数为10％～2％，维持2.4min；18～18.1min流动相B的体积分数回到30％～40％，流动相A的体积分数为60％～70％，维持1.9min，整个过程中流动相的流速始终为0.26ml/min，所述脂质代谢产物待测试样的进样量为2～3μl；

质谱扫描采用的离子源为ESI，扫描模式为Schedule MRM，整个分析过程20min内完成；数据采集过程中MRM扫描模式质谱参数设置如下：正离子模式下离子喷雾电压为4～5.5kV，温度400～550℃，GAS 1和2流速均是50～65，负离子模式下离子喷雾电压为-4.5～-5.5kV，加热温度为400～550℃，GAS 1和2流速设置为40～60，在两种模式下碰撞气与气帘气分别设置为“高”与35～45；

利用R x64 3.5.3、meteboanalyst以及TB tools JRE1.6对步骤S2所得结果进行显著性分析，得出重金属暴露组与对照组相比发生显著变化的差异化合物，对所述差异化合物进行多维统计分析，包括主成分分析、偏最小二乘、热图，得到对照组、重金属暴露组是否出现了组别显著的区分聚类；最后借助KEGG数据库以及metaboanalyst来对所述差异化合物进行通路分析，找出受影响的通路途径。

2.根据权利要求1所述重金属暴露对细胞脂质代谢影响的检测方法，其特征在于，所述步骤S1所述重金属离子为镉离子或砷离子。