[发明专利]检测叶酸多态性位点相关基因的引物组合物、试剂盒以及试剂盒使用方法

说明书

本发明公开了一种检测叶酸多态性位点相关基因的引物组合物、试剂盒以及试剂盒使用方法，根据叶酸多态性位点相关基因进行设计的PCR扩增引物从而得到引物组合物，以及质谱延伸引物；通过现有DNA提取试剂盒，提取待测样本DNA；使用引物组合物通过PCR扩增反应体系，获得靶序列扩增引物；通过SAP酶反应体系处理，除去靶序列扩增引物中含有的未反应的dNTP；使用质谱延伸引物通过延伸反应体系，在延伸引物的3’端连接一个碱基，纯化后，从而得到延伸产物；将纯化后的延伸产物在质谱仪上进行质谱检测；所得到的质谱峰图通过分析软件进行分析，得到分型结果。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及多重PCR扩增技术和基质辅助激光解析电离时间飞行质谱技术(MALDI-TOF-MS)；且更具体而言，本发明涉及一种检测叶酸多态性位点相关基因的引物组合物、试剂盒以及试剂盒使用方法。

背景技术

叶酸属B族维生素，是合成核酸所必须的元素，是细胞生长和组织修复所必需的物质，更是胚胎发育过程中不可缺少的营养素。大量研究证实，叶酸缺乏是导致出生缺陷的主要原因。正常的叶酸除可预防胎儿神经管缺陷外，还能降低孕妇妊娠高血压、自发性流产、胎儿宫内发育迟缓、早产、新生儿低出生体重等疾病的发病率。

研究发现，叶酸利用能力受遗传基因影响。如果与叶酸代谢相关的基因发生变异，它们所产生的酶活性就会下降。这些人即使按照常规剂量(400微克/天)补充叶酸，机体叶酸水平仍然会不足。遗传体质的差异决定了机体对叶酸的吸收和利用能力。因此，叶酸增补应因人而异，增补过多或过少都不利于胎儿健康和孕妇健康。

有一种情况是，许多孕妇是在无意中怀孕的，增补叶酸的时间往往滞后至少2－3个月，错过了补充叶酸的关键时期。在发达国家，新婚期即开始了叶酸的增补。因此，想在近期生育的女性，应该尽早进行叶酸代谢的基因检测，然后确定叶酸的补充方法。

男性增补叶酸对优生有着同等重要的意义。叶酸摄入不足，男性机体叶酸水平偏低，主要会导致两方面的不良后果：一是精子密度低、活性下降、勃起功能减弱；二是精液中携带的染色体数量异常(过多或过少，即精子中出现“非整倍体”)，引起唐氏综合症或流产。

综上所述，通过最先进的科学手段检测每对新婚夫妇对叶酸的利用能力，不仅可以实现个性化增补叶酸，还可以增强新婚夫妇增补叶酸的意识和依从性，从而更有效地降低新生儿出生缺陷风险。

叶酸代谢密切相关的基因是有2个，即MTHFR和MTRR。5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)基因变异引起相应的酶活性降低可使同型半胱氨酸转化为甲硫氨酸减少，导致低叶酸血症和高同型半胱氨酸血症。

1.MTHFR基因

MTHFR基因位于一号染色体lp36.3，全长19.3kb，mRNA全长7105bp，有12个外显子，编码含657个氨基酸的蛋白。

亚甲基四氢叶酸还原酶催化5,10-亚甲基四氢叶酸转换成5-甲基四氢叶酸盐，使之能为同型半胱氨酸提供甲基甲硫氨酸。该酶是人体叶酸代谢中的一个十分重要的酶。

rs1801131是MTHFR基因第八个外显子上第1298(1337)核苷酸的一个A/C多态，引起MTHFR基因编码的蛋白质第429个氨基酸由Glu变为Ala。在世界人群中的该多态的频率分布，A占77％，C占23％。中国人群中的分布A占81％，C为19％。

rs1801131位点的多态性是影响该酶的活性的一个重要因素。携带MTHFR 1298C等基因的酶活性为野生型的68％左右，因而阻碍了叶酸代谢，引起一系列疾病发病风险增加。