[发明专利]一种利用超声匀浆从紫贻贝加工下脚料中提取抗菌肽的制备方法

说明书

本发明属于抗菌肽技术领域。本发明公开了一种利用超声匀浆从紫贻贝加工下脚料中提取抗菌肽的制备方法，其包括预处理、超声匀浆粗提、固相萃取柱富集、凝胶柱和C18色谱柱分离等步骤。本发明中紫贻贝抗菌肽的制备方法工艺简单且成本较低；采用固相萃取柱、凝胶柱和C18色谱柱对紫贻贝抗菌肽进行富集、分离，操作方便且抗菌肽纯度较高、易于工业化生产，所制备的抗菌肽的抑菌效果较强。

技术领域

本发明涉及抗菌肽技术领域，尤其是涉及一种利用超声匀浆从紫贻贝加工下脚料中提取抗菌肽的制备方法。

背景技术

紫贻贝（Mytilus edulis Linnaeus）俗称“海红”、“淡菜”，在我国黄海、渤海、东海和南海北部广泛分布，是我国主要的海洋经济贝类。紫贻贝生产季节性强、产量大、鲜活易腐且不耐贮藏，因此促进了紫贻贝加工业的蓬勃发展，可加工中会产生大量的下脚料——含闭壳肌的熟贝壳、蒸煮液、受损和无商业化价值紫贻贝（6cm，蛋白含量为10~23%）等。目前，对于该下脚料利用研究主要集中于贝壳和蒸煮液，如贝壳粉（CaCO₃）/贝壳煅烧粉（CaO）作为PP塑料填充料、农残/重金属吸附剂、乙醇合成催化剂、食源性致病菌抑菌剂以及蒸煮液制备海鲜调味品与贻贝多糖等，而受损和无商业化价值紫贻贝的利用研究相对较少，笔者仅见Beaulieu等[Beaulieu L, Thibodeau J, Bonnet C, et al. Evidence of anti-proliferative activities in blue mussel (Mytilus edulis) by-products[J].Marine drugs, 2013, 11(4): 975-990.]利用复合蛋白酶水解制备抗增殖活性多肽的研究。因此需对其加以开发利用研究，开发多种产品，进一步提高和拓展其应用价值。

近年来，随着细菌对抗生素耐药性、抗生素残留等问题日益严重，亟需寻找新型抗菌活性物质，因而从自然界中获得天然抗菌活性物质引起了研究者的极大兴趣。滤食性动物贻贝长期生活在富含各种微生物水环境中（菌落总数高达6 log CFU/mL），由于贻贝缺乏特异性的免疫系统，所以其免疫防御主要通过细胞（吞噬、包囊和呼吸爆发等）和体液（凝集素、溶酶体酶、抗菌因子等）进行免疫防御。相对于其它双壳贝类来说，抗菌肽在贻贝抵御致病菌侵袭中发挥着重要作用。抗菌肽具有抑菌活性强、抑菌谱广、不产生耐药性以及无有害残留等优点，所以利用紫贻贝加工下脚料高效提取海洋生物抗菌肽，是紫贻贝加工下脚开发研究的方向。因此，开发出工艺简单可行，得率高且抑菌效果好的贻贝抗菌肽，不仅进一步拓展紫贻贝应用范围，而且也提高贻贝加工下脚料的附加值。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种紫贻贝抗菌肽的得率较高、抑菌效果好并且具有工艺简单等特点的利用超声匀浆从紫贻贝加工下脚料中提取抗菌肽的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种利用超声匀浆技术从紫贻贝加工下脚料中提取抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：

a）预处理：紫贻加工下脚料（受损和无商业化价值紫贻贝）半解冻后，取肉、清洗，沥干后冻藏备用；

b）粗提：将紫贻贝肉与乙酸溶液混合并煮沸，冰水浴冷却；冰水浴中超声匀浆处理，超声匀浆处理后离心处理得到上清液A，将上清液A冷冻干燥得到粗提物；

c）固相萃取：将粗提物溶解于三氟乙酸溶液中并离心处理得到上清液B，将上清液过固相萃取柱1～2次，接着依次用三氟乙酸溶液和乙腈溶液洗脱处理，收集乙腈洗脱液并冷冻干燥制得抗菌肽粗品A；

d）凝胶柱分离：将抗菌肽粗品A用水溶解，离心处理得到上清液C，然后在凝胶柱中分离纯化，收集合并洗脱峰并冷冻干燥制得抗菌肽粗品B；

e）色谱柱分离：将抗菌肽粗品B配制成多肽溶液，离心处理得到上清液D并进行色谱柱分离处理，收集合并洗脱峰，冷冻干燥后制得紫贻贝抗菌肽。