[发明专利]一种利用超声匀浆从紫贻贝加工下脚料中提取抗菌肽的制备方法

权利要求书

1.一种利用超声匀浆从紫贻贝加工下脚料中提取抗菌肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

a）预处理：紫贻加工下脚料半解冻后，取肉、清洗，沥干后冻藏备用；

b）粗提：将紫贻贝肉与乙酸溶液混合并煮沸，冰水浴冷却；冰水浴中超声匀浆处理，超声匀浆处理后离心处理得到上清液A，将上清液A冷冻干燥得到粗提物；

c）固相萃取：将粗提物溶解于三氟乙酸溶液中并离心处理得到上清液B，将上清液过固相萃取柱1～2次，接着依次用三氟乙酸溶液和乙腈溶液洗脱处理，收集乙腈洗脱液并冷冻干燥制得抗菌肽粗品A；三氟乙酸溶液的浓度为0.008～0.012wt%，乙腈溶液的浓度为35～45wt%，固相萃取柱填料为C18填料；

d）凝胶柱分离：将抗菌肽粗品A用水溶解，离心处理得到上清液C，然后在凝胶柱中分离纯化，收集合并洗脱峰并冷冻干燥制得抗菌肽粗品B，所述凝胶柱为Sephadex G-10凝胶柱，洗脱液为去离子水；

e）色谱柱分离：将抗菌肽粗品B配制成多肽溶液，离心处理得到上清液D并进行色谱柱分离处理，收集合并洗脱峰，冷冻干燥后制得紫贻贝抗菌肽；所述色谱柱为C18色谱柱；洗脱液为乙腈和0.01%三氟乙酸溶液；采用梯度洗脱方法，在1h内乙腈浓度在由0提高到40%。

2.根据权利要求1所述的一种利用超声匀浆从紫贻贝加工下脚料中提取抗菌肽的制备方法，其特征在于：

所述步骤b）中，乙酸溶液的浓度为0.5～2.0wt%。

3.根据权利要求1或2任一所述的一种利用超声匀浆从紫贻贝加工下脚料中提取抗菌肽的制备方法，其特征在于：

所述步骤b）具体为，将紫贻贝肉与乙酸溶液混合并煮沸10～20分钟，冰水浴冷却后，冰水浴中以转速8000～12000rpm、超声功率100～300w进行超声匀浆处理时间10～30min，超声匀浆处理后在1～5℃下以10000～12000×g相对离心力离心处理20～40分钟得到上清液A，将上清液A冷冻干燥得到粗提物；所述紫贻贝肉与乙酸溶液按1：2～3比例进行混合。

4.根据权利要求1所述的一种利用超声匀浆从紫贻贝加工下脚料中提取抗菌肽的制备方法，其特征在于：

所述步骤c）具体为，粗提物溶于三氟乙酸溶液配制成8～12mg/mL浓度多肽溶液，12000rpm离心5min获得上清液B，将等柱体积上清液B过固相萃取柱1～2次，接着依次用等柱体积三氟乙酸溶液洗脱3～5次，再用等柱体积乙腈溶液洗脱1次，收集乙腈洗脱液并冷冻干燥制得抗菌肽粗品A。

5.根据权利要求4所述的一种利用超声匀浆从紫贻贝加工下脚料中提取抗菌肽的制备方法，其特征在于：

所述步骤c）在固相萃取前对固相萃取柱进行以下处理，用2～3倍柱体积乙腈洗脱固相萃取柱，接着使用3～5倍柱体积的0.008～0.012wt%浓度的三氟乙酸溶液洗脱固相萃取柱，洗脱速度控制在1.5～3mL/min范围。

6.根据权利要求1所述的一种利用超声匀浆从紫贻贝加工下脚料中提取抗菌肽的制备方法，其特征在于：

所述步骤d）具体为，将抗菌肽粗品A用超纯水溶解制得100mg/mL抗菌肽溶液，并以10000～14000×g相对离心力离心处理5～15分钟得到上清液C，然后在Sephadex G-10凝胶柱中分离纯化，收集合并洗脱峰并冷冻干燥制得抗菌肽粗品B。

7.根据权利要求1所述的一种利用超声匀浆从紫贻贝加工下脚料中提取抗菌肽的制备方法，其特征在于：

所述步骤d）中凝胶柱的参数为，上样量100μL、检测波长220nm、流速0.4mL/min。

8.根据权利要求1所述的一种利用超声匀浆从紫贻贝加工下脚料中提取抗菌肽的制备方法，其特征在于：

所述步骤e）具体为，将抗菌肽粗品B用0.008～0.012wt%浓度的三氟乙酸配置成1mg/mL的溶液，以10000～14000×g相对离心力离心处理8～12分钟得到上清液D并采用C18色谱柱进行色谱柱分离处理，收集合并洗脱峰，冷冻干燥制得紫贻贝抗菌肽。

9.根据权利要求1所述的一种利用超声匀浆从紫贻贝加工下脚料中提取抗菌肽的制备方法，其特征在于：

所述步骤e）中C18色谱柱参数设定为，检测段波长220nm，色谱柱温为25℃，流度0.4mL/min，上样体积100μL。