[发明专利]一种分枝杆菌基因工程菌的构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种分枝杆菌基因工程菌的构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明将重组质粒经转化进入分枝杆菌LY‑1细胞后，sgRNA会识别基因组上的特定区域并引导Cas9蛋白结合到目标位点，在该蛋白的作用下，目标位点处形成一个双链断裂的缺口，绝大多数的细胞因此死亡：随重组质粒引入的同源修复序列在重组酶的作用下通过双交换整合至缺口处，基因同源修复成功的细胞就此存活下来，并形成基因失活和外源基因插入等人工设计的基因型。本发明所构建的CRISPR‑Cas9系统针对同一基因的敲除效率为60％，与现有的分枝杆菌基因编辑方式相比更为便捷和高效。

技术领域

本发明涉及一种分枝杆菌基因工程菌的构建方法与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

甾体类药物具有重要的生理活性，在临床上被广泛用于治疗风湿病、心血管、胶原性病症、淋巴白血病、人体器官移植、抗肿瘤、细菌性脑炎、皮肤病、内分泌失调、老年性疾病等，是仅次于抗生素的第二大类药物，目前全球范围内甾体药物的年销售额超过1000亿美元。9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)作为甾体激素类药物的重要前体，其结构中特殊的α-构型羟基，是获得卤代皮质类激素的重要前体，如地塞米松、倍他米松、及糠酸莫米松等，具有重要的商业价值和广泛的市场需求。

微生物发酵生产甾醇类物质，能够简化工艺路线，减少生产成本，而分枝杆菌是工业中降解甾醇类物质生产9α-OH-AD的重要微生物，其中包含复杂的催化酶系，9α-OH-AD是由雄烯二酮(AD)的第九位羟化所得，而同时AD与9α-OH-AD均可被3-甾酮-Δ¹-脱氢酶(3-ketosteroid-Δ¹-dehydrogenase)与17β-羟基类固醇脱氢酶(17β-hydroxysteroiddehydrogenase)分别降解为雄二烯二酮(ADD)、9α-羟基-雄二烯二酮(9α-OH-ADD)、睾酮(T)、9α-羟基睾酮(9α-OH-T)，正是由于其复杂的酶催化体系，一方面甾醇代谢过程中不仅生成9α-OH-AD，还有许多副产物；另一方面也降低了目的产物9α-OH-AD的摩尔得率。

CRISPR/Cas技术是继锌指核酸酶(ZFN)、ES细胞打靶和TALEN等技术后可用于定点构建基因的第四种方法，且有效率高、速度快及简单经济的特点，在模型构建等方面的应用前景将非常广阔，CRISPR/Cas介导的基因组编辑技术以其操作简单、特异性高、可同时编辑多个基因的特点成为研究热点。对于分枝杆菌而言，传统的同源重组技术，仍具有效率低、步骤复杂等缺点，故本发明拟在野生菌株分枝杆菌中构建CRISPR/Cas技术。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种分枝杆菌基因工程菌的构建方法，首次在野生菌株分枝杆菌Mycobacterium sp.LY-1，该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.13031中构建稳定且高效的CRISPR/Cas9基因编辑体系，并应用在该菌的代谢改造中，获得多个基因工程菌株，能够获得巨大的甾体类药物的经济效益。

本发明的第一个目的是提供一种分枝杆菌基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的针对分枝杆菌经过密码子优化Cas蛋白表达框、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的sgRNAscaffold表达框，并以目的基因为靶点设计合成sgRNA片段；

(2)将步骤(1)中的Cas9蛋白表达框克隆到出发载体中；

(3)提取分枝杆菌基因组DNA，使用DNA聚合酶及引物扩增获得目的基因上下游基因片段作为基因编辑修复序列；

(4)将以目的基因为靶位点设计合成的sgRNA片段连接至步骤(2)得到的载体中，再连接步骤(3)制备的基因编辑修复序列，获得所述的分枝杆菌基因组编辑载体；

(5)将步骤(4)得到的基因编辑载体转化至分枝杆菌中，培养筛选得到所述的分枝杆菌基因工程菌。