[发明专利]一种分枝杆菌基因工程菌的构建方法与应用有效
| 申请号： | 201910973777.9 | 申请日： | 2019-10-14 |
| 公开（公告）号： | CN110791468B | 公开（公告）日： | 2021-11-23 |
| 发明（设计）人： | 许正宏;李会;史劲松;许桠楠;张晓梅;龚劲松 | 申请（专利权）人： | 江南大学 |
| 主分类号： | C12N1/21 | 分类号： | C12N1/21;C12P33/06;C12R1/32 |
| 代理公司： | 苏州市中南伟业知识产权代理事务所(普通合伙) 32257 | 代理人： | 冯瑞 |
| 地址： | 214122 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 分枝杆菌 基因工程 构建 方法 应用 | ||
1.一种分枝杆菌基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌敲除了3-甾酮-△1-脱氢酶和17β-羟基类固醇脱氢酶的编码基因，并过表达了3-甾酮-9α-羟基化酶；所述的基因工程菌通过如下步骤进行构建：
（1）合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的针对分枝杆菌经过密码子优化Cas蛋白表达框、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的sgRNA scaffold表达框，并以目的基因为靶点设计合成sgRNA片段；
（2）将步骤（1）中的Cas9蛋白表达框通过如SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列连接到出发载体pMV261中；
（3）提取分枝杆菌基因组DNA，使用DNA聚合酶及引物扩增获得目的基因上下游基因片段作为基因编辑修复序列；
（4）将以目的基因为靶位点设计合成的sgRNA片段连接至步骤（2）得到的载体中，再连接步骤（3）制备的基因编辑修复序列，获得所述的分枝杆菌基因组编辑载体；
（5）将步骤（4）得到的基因编辑载体转化至分枝杆菌中，培养筛选得到所述的分枝杆菌基因工程菌；
所述的3-甾酮-△1-脱氢酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ-ID-NO.8所示；
所述的17β-羟基类固醇脱氢酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
所述的3-甾酮-9α-羟基化酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；
所述的分枝杆菌基因工程菌的宿主菌为分枝杆菌
2.权利要求1所述的分枝杆菌基因工程菌在生产9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮（9α-OH-AD）中的应用。
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