[发明专利]一种农杆菌介导的细叶百合鳞片高效遗传转化体系

说明书

本发明公开了一种农杆菌介导的细叶百合鳞片高效遗传转化体系，包括以下步骤：抗生素卡那霉素适宜浓度筛选；菌液的制备；预培养；侵染；共培养；筛选培养；抗性苗获得；转基因植株的PCR检测。本发明以细叶百合无菌小鳞片为转化材料，通过对农杆菌转化过程中的主要转化条件进行优化，建立了一种农杆菌介导的细叶百合鳞片高效遗传转化体系，将绿色荧光蛋白基因GFP转入细叶百合，转化率达到16.13％。其优势在于以细叶百合鳞片为转化受体的直接再生途径，再生率高，变异率和假阳性率低，转化周期短，约3.5个月即可获得完整植株，转化率高，为百合的分子育种、种质资源创制及品种改良奠定基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域的百合遗传转化方法，具体涉及一种以鳞片为转化受体，建立农杆菌介导的细叶百合高效遗传转化体系的方法。

背景技术

细叶百合(Lilium pumilum)又名山丹，原产于中国北方寒冷地区，花瓣向外反卷，花色鲜红，观赏价值极高，可直接应用于园林景观中；并且具有较强的抗旱、抗寒、抗盐碱的能力，是百合抗性育种的重要亲本。近几年来，对于细叶百合的研究主要集中在杂交育种以及分类学上，而关于其基因工程方面的研究少有报道。采用常规的育种技术来改良植物的品种不仅耗时费力，并且难度大，而利用基因工程手段，向植物中导入外源目的基因，是快速有效改良植物品种的重要途径，具有广泛的发展前景。因此，通过基因工程来培育细叶百合新品种，对于园林发展具有重要的意义。

用于百合转基因的方法主要是农杆菌介导法与基因枪法，相比于后者，由于农杆菌可以引起植物发生可遗传变异、拷贝数少、插入位点固定、后代遗传简单等优点，农杆菌介导法常被采用。但百合是单子叶植物，利用农杆菌介导法进行基因转化，可能会出现一些问题，如对农杆菌具有不敏感性、T-DNA整合不稳定、转化植株性状遗传稳定性差等。目前仅有少数农杆菌介导百合转化成功的研究报道，离实用化阶段仍有一定的距离，因此，建立高效的百合遗传转化体系具有重要的意义。

发明内容

针对已有技术的不足，本发明的目的在于提供一种农杆菌介导的细叶百合鳞片高效遗传转化的方法。包括Kan(卡那霉素)对细叶百合鳞片最适筛选浓度，农杆菌侵染过程中的最适菌液浓度、侵染时间、AS(乙酰丁香酮)用量的研究。

为了实现上述目的，本发明采取如下技术解决方案：

1、抗生素敏感性试验

将切成0.5cm²大小的细叶百合小鳞片接种于添加不同浓度Kan的培养基(MS+1.5mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+400mg/L Cef)上进行培养，定期观察小鳞片的生长状态并统计褐化率，确定Kan对小鳞片的最适筛选浓度为120mg/L。

2、细叶百合遗传转化条件优化

采用农杆菌介导法，在不同转化条件下，经农杆菌侵染并抗性筛选的细叶百合小鳞片，40d后统计抗性芽产生率，比较并确定最适的遗传转化条件：农杆菌菌液浓度为OD₆₀₀＝0.7，侵染时间为15min，侵染液及共培养基中所加AS浓度为20mg/L。

3、侵染液的制备

将含有绿色荧光蛋白基因GFP的农杆菌菌液在YEP+50mg/L Kan+100mg/L Rif的固体培养基上划线，28℃下暗培养48h后，挑取长势较好的单菌落，接种于10mL附加50mg/L Kan和100mg/L Rif的YEP液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养24h后，从中吸取菌液按1:100的比例加入到50ml含有50mg/L Kan和100mg/L Rif的YEP液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.7。将活化后的菌液4500rpm离心10min，弃去上清，用含有20mg/L AS的1/2MS(不含NH₄NO₃)液体培养基(PH＝5.7)悬浮菌体沉淀，200rpm震荡1.5-2h，即为转化用的侵染液。