[发明专利]一种农杆菌介导的细叶百合鳞片高效遗传转化体系

权利要求书

1.一种农杆菌介导的细叶百合鳞片高效遗传转化体系，包括以下步骤：

(1)抗生素敏感性试验

将切成0.5cm²大小的细叶百合小鳞片接种于添加不同浓度Kan(卡那霉素)的培养基(MS+1.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+400mg/L Cef)上进行培养，定期观察小鳞片的生长状态并统计褐化率，确定Kan对小鳞片的最适筛选浓度为120mg/L。

(2)细叶百合遗传转化条件优化

采用农杆菌介导法，在不同转化条件下，经农杆菌侵染并抗性筛选的细叶百合小鳞片，40d后统计抗性芽产生率，比较并确定最适的遗传转化条件：农杆菌菌液浓度为OD₆₀₀＝0.7，侵染时间为15min，侵染液及共培养基中所加AS(乙酰丁香酮)浓度为20mg/L。

(3)侵染液的制备

将含有绿色荧光蛋白基因GFP的农杆菌菌液在YEP+50mg/L Kan+100mg/L Rif的固体培养基上划线，28℃下暗培养48h后，挑取长势较好的单菌落，接种于10mL附加50mg/L Kan和100mg/L Rif的YEP液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养24h后，从中吸取菌液按1:100的比例加入到50ml含有50mg/L Kan和100mg/L Rif的YEP液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.7。将活化后的菌液4500rpm离心10min，弃去上清，用含有20mg/L AS的1/2MS(不含NH₄NO₃)液体培养基(PH＝5.7)悬浮菌体沉淀，200rpm震荡1.5-2h，即为转化用的侵染液。

(4)预培养

将细叶百合小鳞片切成0.5cm²大小，放在预培养基(MS+1.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA)上，25℃暗培养3d。

(5)侵染

将预培养后的细叶百合小鳞片放在已制备好的侵染液中侵染15min，期间不断轻轻震荡，使侵染液与小鳞片充分接触，取出后置于无菌的滤纸上吸干表面附着的菌液。

(6)共培养

将侵染后的细叶百合小鳞片接种在共培养基[MS(不含NH₄NO₃)+1.5mg/L 6-BA+0.5mg/LNAA+20mg/L AS]上，25℃黑暗培养3d。

(7)筛选培养

将共培养后的细叶百合小鳞片接种在筛选培养基(MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+120mg/L Kan+400mg/L Cef)上光照培养，进行抗性筛选，每隔2周转接到新的相同培养基上，期间剔除褐化的小鳞片。

(8)抗性苗获得

待筛选出的细叶百合小鳞片长出1cm左右的不定芽时，将不定芽切下并转移到生根培养基(1/2MS+0.2mg/L IBA+100mg/L Kan+400mg/L Cef)上诱导生根，每隔3周转接到新的相同培养基上，期间剔除白化的小苗，得到抗性苗。

(9)PCR检测

以细叶百合总DNA为模板，对获得的抗性苗进行PCR检测，如果得到与目的基因绿色荧光蛋白基因GFP大小一致的条带，则说明目的基因已整合到转基因细叶百合基因组中。

2.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的细叶百合鳞片高效遗传转化体系，其特征在于，所述的农杆菌为EH105农杆菌，含植物表达载体PBI121，携带有抗卡那霉素基因nptⅡ和绿色荧光蛋白基因GFP。